Manuale di Base sulla Cromatografia Liquida Preparativa

Se una separazione isocratica o un gradiente focalizzato non risolve il composto di interesse in modo adeguato, la separazione può essere sviluppata nuovamente tramite variazioni di solvente, pH, fase stazionaria e/o temperatura. Questi tipi di modifiche possono avere un notevole impatto sulla separazione, pertanto dopo aver apportato una qualsiasi di queste modifiche è necessario esplorare i gradienti in seguito all’ottimizzazione del metodo.

Solvente

La fase mobile HPLC è costituita da tre componenti: solvente debole, solvente forte e modificatore. I solventi devono essere di elevata purezza, compatibili con il rivelatore, non reattivi con il campione e avere una bassa viscosità per mantenere bassa la contro-pressione del sistema.

Nella cromatografia in fase inversa il solvente debole è quasi sempre l’acqua, mentre l’acetonitrile e/o il metanolo sono usati comunemente come solventi forti a causa della bassa viscosità, dell’elevata resistenza e della preferenza UV nell’intervallo di lunghezze d’onda basse. Inoltre, l’acetonitrile e il metanolo garantiscono la migliore forma del picco, evaporano facilmente dopo l’isolamento e tendono a non essere reattivi con la maggior parte dei campioni.

Come con qualsiasi solvente utilizzato per la separazione cromatografica, è importante rimanere al di sopra del valore limite UV del solvente riportato durante l’analisi del campione. Al di sotto di questo valore, il rivelatore registra le variazioni nella composizione del solvente come deriva della linea di base o altri disturbi cromatografici.

La separazione e l’ordine dei picchi possono variare a seconda del solvente forte utilizzato per la separazione. È difficile prevedere il solvente che fornirà la risoluzione più elevata per il composto di interesse, pertanto la scelta di un solvente forte spesso deriva da tentativi ed errori. Facoltativamente, è possibile miscelare solventi forti (per esempio, acetonitrile/metanolo al 50:50) per ottenere la risoluzione o l’ordine di eluizione desiderato.

pH

Il pH della fase mobile è una variabile molto importante nel controllo della ritenzione per le separazioni in fase inversa. I composti contengono spesso uno o più gruppi funzionali acidi o basici, pertanto la maggior parte delle fasi mobili in fase inversa richiede il controllo del pH.

Quando un acido è più di 2 unità di pH al di sopra o al di sotto del suo pK_a, sarà rispettivamente ionizzato a >99% o unionizzato. Al contrario, le basi vengono ionizzate al di sotto del loro pK_a e non ionizzate al di sopra del loro pK_a. La forma unionizzata sarà meno polare (più idrofobica) e quindi trattenuta più fortemente in un sistema in fase inversa. Di conseguenza, gli acidi vengono trattenuti meglio a pH basso, mentre le basi vengono trattenute meglio a pH alto.

Se il pH della fase mobile è vicino al pK_a del composto di interesse, piccole variazioni di pH possono determinare ampie variazioni di ritenzione, che possono incidere direttamente sulla robustezza della separazione. Il pH della fase mobile viene controllato mediante l’aggiunta di un tampone. Il tampone mantiene il pH quando viene aggiunta una piccola quantità di acido o base. È più efficace se utilizzato entro ±1 unità di pH dal relativo pK_a, ma potrebbe fornire un’azione tampone adeguata a ±2 unità di pH dal pK_a.

Quando si seleziona un pH di lavoro, è necessario prendere in considerazione anche la stabilità della colonna.

Il funzionamento migliore per le colonne a base di silice è tra pH 2 e pH 8. Una fase legata è suscettibile di idrolisi a pH basso e a pH alto la struttura portante della silice diventa sempre più solubile. A pH superiori a 8 è necessaria una particella non a base di silice o una particella con un ligando progettato specificamente per un’elevata stabilità del pH. I limiti di pH e i consigli generali per l’utilizzo sono indicati nel foglietto illustrativo della colonna o sul sito web del produttore della colonna.

Quando si prevede l’utilizzo di un metodo cromatografico ai fini della purificazione, gli additivi tampone utilizzati per regolare il pH devono essere adeguatamente volatili per facilitare la rimozione dall’isolato purificato. Inoltre, quando si utilizzano additivi volatili, prestare attenzione per evitare la contaminazione o la precipitazione nella sorgente MS. Additivi comuni come l’acido formico, l’acido acetico e l’acetato di ammonio funzionano meglio a una concentrazione compresa tra lo 0,05% e lo 0,1% quando dissolti nella fase mobile. Il fosfato, l’additivo tampone più diffuso per le separazioni cromatografiche liquide, non è consigliato per le applicazioni di purificazione o MS.

Si consigliano concentrazioni del tampone comprese tra 5 e 10 mM. Quando si utilizzano i tamponi, è importante filtrarli dopo la preparazione e lavare le linee della pompa quando non vengono utilizzate per evitare la precipitazione in linea e sostituire regolarmente le soluzioni per prevenire l’accumulo di proliferazione biologica.

Fase Stazionaria

La fase stazionaria della colonna ha un impatto significativo sulla separazione. Fasi stazionarie per l’intervallo di fase inversa da C₁₈ a C₈ o che possono contenere ligandi ingegnerizzati per promuovere la selettività e il potere di separazione. Molti laboratori hanno un inventario di colonne limitato, quindi la sostituzione della fase stazionaria è spesso l’ultima risorsa quando solvente e pH non forniscono una risoluzione adeguata. La Waters Reversed-Phase Selectivity Chart (www.waters.com) fornisce un confronto della selettività tra diversi produttori di fasi stazionarie per colonne. Questo strumento è molto utile nelle prime fasi dello sviluppo di metodi per confrontare la selettività delle colonne.

Lunghezza

La lunghezza della colonna è un fattore determinante nelle prestazioni di separazione. È possibile acquistare colonne di lunghezze diverse, tra cui 25 mm, 50 mm, 100 mm, 150 mm e 250 mm.

Colonne più corte hanno piatti teorici più bassi, ma sono adatte per separazioni rapide, mentre colonne più lunghe hanno piatti teorici più alti e comportano tempi di ritenzione più lunghi. Poiché lunghezza, contro-pressione, tempo di analisi, consumo di solvente e costi incrementano in modo proporzionale, la colonna più corta che fornisce una risoluzione adeguata rappresenta l’opzione ideale.

Dimensioni delle Particelle

La capacità della colonna di resistere alla dispersione o all’allargamento di una banda di campione durante il passaggio attraverso il letto impaccato è definita “efficienza”. Particelle di dimensioni inferiori incrementano l’efficienza perché la dispersione dei picchi è inferiore all’interno delle particelle. L’efficienza elevata si traduce in picchi di ampiezza ridotta e in un migliore potere di separazione.

Le dimensioni delle particelle delle colonne preparative sono generalmente comprese tra 5 e 10 µm, mentre le separazioni analitiche a pressione ultra-elevata utilizzano particelle di dimensioni pari a 1,7-3,5 µm. Sebbene particelle di dimensioni molto ridotte forniscano una maggiore efficienza, il compromesso è un incremento del costo della colonna e della contro-pressione del sistema. Per questi motivi, spesso le colonne preparative su larga scala, che funzionano a velocità di flusso elevate con miscele di campioni grezzi, non sono disponibili con particelle di dimensioni molto ridotte.

Temperatura

Poiché temperature diverse possono influire sulla selettività, riscaldare la colonna è uno strumento utile per ottimizzare la separazione di un campione specifico. La viscosità della fase mobile e la pressione totale del sistema si riducono con l’aumento della temperatura, il che si traduce in una minore sollecitazione del sistema, dei raccordi e della colonna, fino a incrementare la robustezza del funzionamento. Anche la temperatura può ridurre i tempi di ritenzione e modificare la selettività della separazione. È difficile prevedere se le variazioni di temperatura incrementeranno o diminuiranno la risoluzione dei picchi, pertanto l’utilità è specifica per ogni separazione specifica.

Mentre il controllo della temperatura nella cromatografia su piccola scala è di routine, la temperatura è impiegata raramente come parametro per manipolare la cromatografia destinata alla purificazione su scala preparativa. In primo luogo, colonne di grande diametro possono essere difficili da riscaldare uniformemente dall’esterno. In secondo luogo, le separazioni ad alta velocità di flusso usate su larga scala tendono a rimanere alla temperatura del solvente in ingresso. I mantelli elettrici e i forni colonna, sebbene soddisfacenti per separazioni su piccola scala, non sono in grado di riscaldare una colonna di grandi dimensioni in modo uniforme lungo l’intero diametro della colonna. Di conseguenza, sul diametro della colonna si formano gradienti di temperatura che influiscono negativamente sulla cromatografia.

Se il controllo della temperatura è necessario per mantenere la solubilità del campione, è possibile superare i gradienti di temperatura collocando la colonna preparativa in un bagnomaria riscaldato con un tratto di tubo collegato alla testa della colonna. Il tratto di tubo funge da preriscaldatore per equilibrare il solvente in ingresso alla temperatura desiderata. La cromatografia destinata a uno scale-up futuro viene sviluppata al meglio in condizioni ambiente e il controllo della temperatura è utilizzato come ultima risorsa.