Approcci Pratici all'Isolamento dei Peptidi

Selezione della colonna

Teoricamente, l'utilizzo di un'unica chimica di colonna per tutti i campioni, inclusi peptidi ordinari (con una miscela di residui acidi, basici e non polari), peptidi basici, peptidi di grandi dimensioni (30–40 residui) e peptidi idrofobici, riduce l'inventario delle colonne ed elimina la necessità di eseguire lo screening di più colonne per ciascun campione grezzo. Sebbene le fasi C₁₈ siano in genere utilizzate per molte separazioni di peptidi, la particella base a cui è legata la C₁₈ è anche un fattore critico che influenza la ritenzione cromatografica, la risoluzione e la forma del picco. Le colonne XBridge Peptide BEH sono basate su particelle ibride collegate a ponte con etilene anziché su silice pura. La particella BEH (Bridged Ethylsiloxane/Silica Hybrid) (Figura 7) riduce al minimo le interazioni secondarie con i peptidi ed è stabile a pH alto e basso per la massima flessibilità nello sviluppo delle separazioni. Il materiale di impaccamento sintetico è disponibile con pori da 130 Å o 300 Å con particelle di dimensioni pari a 3,5, 5 e 10 µm. Per campioni atipici o peptidi estremamente idrofobici, la stessa particella base è disponibile con fasi legate C₈ o C₄.

Nella Tabella 1 vengono mostrate le capacità approssimate di caricamento della massa dei peptidi su colonne di varie dimensioni.

Tabella 1. Capacità di caricamento approssimata della massa dei peptidi per la fase inversa

*Colonne di preparazione OBD da 5 µm e 10 µm; ** Colonne di preparazione OBD da 10 µm.

Molti fattori influiscono sulla capacità di massa delle colonne preparative. Le capacità elencate rappresentano una stima "media" con velocità di flusso e volumi di iniezione ragionevoli per ciascuna dimensione. I seguenti fattori sono degni di considerazione:
1) La capacità dei peptidi dipende principalmente dalla solubilità del particolare campione.
2) La capacità è inferiore laddove è richiesta una risoluzione più elevata.
3) La capacità dipende dalle condizioni di caricamento, ma in misura minore rispetto alle molecole di piccole dimensioni.
a) I peptidi vengono generalmente caricati in condizioni altamente acquose, spesso con l'aggiunta di TFA. La capacità di caricamento del volume in queste condizioni è teoricamente illimitata. La capacità è limitata dalla solubilità durante l'eluizione.
b) I peptidi essiccati possono essere bagnati con solventi come DMF o DMSO. Sono spesso quindi diluiti con acqua contenente TFA, come sopra.
c) In alcuni casi, i peptidi vengono disciolti in DMF o DMSO e iniettati in tale soluzione. Le linee guida relative al volume nel grafico si applicano a questa condizione.
4) Volumi di iniezione ragionevoli si basano sul diametro della colonna per una lunghezza di 50 mm con solventi relativamente forti. L'aumento della lunghezza è compatibile con un volume di iniezione maggiore, ma non in proporzione. Solventi più deboli aumentano in modo significativo il volume di iniezione.
5) Le velocità di flusso ragionevoli si basano sul diametro della colonna. I sistemi sono limitati dall'aumento della contro-pressione all'aumentare della lunghezza e della riduzione delle dimensioni delle particelle. Alcuni utenti preferiscono analizzare i peptidi più lentamente rispetto alle piccole molecole, pertanto utilizzano la metà della velocità di flusso consigliata ma con una durata doppia del gradiente.

L'idoneità di XBridge Peptide BEH C₁₈ 130 come colonna preferita per gli isolamenti peptidici standard è stata definita dai risultati ottenuti dopo aver testato un pannello di quattro peptidi con proprietà diverse. Le sequenze peptidiche sono proprietarie, ma le proprietà notevoli di ciascun peptide sono elencate nella Tabella 2.

Tabella 2. Proprietà del pannello di test dei peptidi

I peptidi sono anfiprotici per la presenza di gruppi funzionali sia debolmente acidi (acido carbossilico) sia debolmente basici (ammino). Poiché i peptidi hanno carica sia positiva che negativa, sono chiamati zwitterioni. Se un peptide è soggetto a un campo elettrico quando disciolto in una soluzione con una concentrazione di ioni idrogeno specifica e non migra, tale concentrazione di ioni idrogeno è il punto isoelettrico (pI) del peptide. Per semplificare, quindi, il punto isoelettrico (pI) è il pH al quale il peptide ha carica netta zero.

Come descritto da Browne, Bennet e Solomon, l'indice HPLC prevede la percentuale di acetonitrile necessaria per eluire il peptide da una colonna C₁₈ µBondapak utilizzando TFA:acqua:acetonitrile come sistema di tamponi. I ricercatori hanno isolato i peptidi da matrici biologiche e ne hanno previsto il profilo di eluizione in base alla composizione amminoacidica. Valori elevati dell'indice HPLC suggeriscono quindi una maggiore idrofobicità su una colonna C₁₈. I valori cambiano, ovviamente, con colonne e fasi mobili diverse, ma questo sistema diretto fornisce alcune informazioni predittive sulla natura dei peptidi.

I profili cromatografici dei quattro peptidi nel pannello di test, in condizioni molto comuni - 0,1% di acido formico in acqua e in acetonitrile con un gradiente da 5–50%B in 50 minuti - sono mostrati in Figura 8. Tutti e quattro i peptidi modello mostrano una cromatografia perfettamente accettabile con picchi acuti e simmetrici.

È importante considerare se ci sarebbe qualche miglioramento cromatografico per i peptidi grandi o idrofobici utilizzando una colonna con pori di 300 Å. Il peptide più grande nel pannello di test dei peptidi, con 39 residui e un peso molecolare superiore a 4000 Da, mostra pochi miglioramenti nella forma del picco con il materiale di impaccamento con pori di dimensioni maggiori (Figura 9). Il peptide eluisce poco prima, con una differenza equivalente a circa 1–2% di acetonitrile. L'utilizzo del materiale di impaccamento con pori di dimensioni pari a 130 Å presenta un limite dimensionale. È molto probabile che questo sia superiore a circa 40 residui.

Anche il peptide idrofobico, con un indice HPLC di 113, eluisce come picco netto e simmetrico su entrambi gli impaccamenti da 130 Å e 300 Å (Figura 10). Anche la conformazione del peptide, ossia il modo in cui il peptide è ripiegato in soluzione, può influenzare la scelta migliore delle dimensioni dei pori per una particolare separazione. Così come non esistono regole rigide per la capacità di caricamento dei peptidi, anche le proprietà dei singoli peptidi svolgono un ruolo nel decidere la migliore dimensione dei pori da utilizzare. Dagli esperimenti discussi in precedenza, si può suggerire che le colonne XBridge Peptide BEH, con fase legata C₁₈ e area con pori da 130 Å, siano una scelta ragionevole come punto di partenza per l'isolamento dei peptidi.

Dal punto di vista dell'economia e dell'efficienza nell'esecuzione dell'isolamento dei peptidi su scala più ampia, è importante considerare la dimensione delle particelle. Il peptide basico, analizzato su tre colonne di dimensioni diverse, illustra la coerenza della separazione (Figura 11). Sebbene i picchi siano più ampi e meno ben risolti con particelle di dimensioni maggiori, per impaccamenti di colonne BEH scalabili la selettività chimica rimane invariata indipendentemente dalle dimensioni delle particelle pari a 3,5, 5 o 10 µm. Gli isolamenti su larga scala beneficiano di maggiori dimensioni delle particelle, consentendo velocità di flusso più elevate su colonne di diametro sempre più ampio con limiti di pressione gestibili; tutti questi fattori migliorano la capacità di caricamento, riducono il numero di analisi cromatografiche e permettono di risparmiare tempo e risorse.

Sebbene i peptidi abbiano proprietà uniche che influiscono sul successo del loro isolamento da miscele grezze, si applicano sempre i principi di base della cromatografia di preparazione. Mentre il protocollo standard di isolamento dei peptidi con un gradiente generico (come 5–50%B o 5–95%B) su una colonna a fase inversa può essere utilizzato per la maggior parte del tempo, a volte peptidi con proprietà uniche necessitano dello sviluppo di metodi di separazione per soddisfare determinati requisiti di purezza, caricamento o di rendimento. I metodi di separazione possono spesso essere migliorati modificando il solvente in fase mobile, il modificatore, la pendenza del gradiente, la temperatura, il pH o il metodo di introduzione del campione. Ciascuno di questi fattori incide sulla separazione, sulla qualità della cromatografia e sulla riuscita finale dell'isolamento.

Ruolo del Solvente

La fase mobile è costituita da tre componenti: il solvente debole, il solvente forte e il modificatore. Nella cromatografia in fase inversa, il solvente debole è quasi sempre l'acqua. Anche se metanolo, etanolo o isopropanolo possono essere presi in considerazione come solvente forte, l'acetonitrile è in genere il solvente preferito a causa della sua bassa viscosità, della sua forza leggermente superiore e della sua usabilità nell'intervallo di rivelazione UV a bassa lunghezza d'onda (185–205 nm). L'acetonitrile in genere fornisce la migliore forma dei picchi, è facile da evaporare e riduce il numero di reazioni secondarie che possono verificarsi durante l'isolamento e l'analisi. Una buona trasparenza UV fornisce un elevato rapporto segnale/rumore per una migliore rivelazione dei picchi. Alcuni utenti, tuttavia, potrebbero contestare l'uso dell'acetonitrile se desiderano utilizzare il peptide in test biologici.

La sostituzione con alcol, per esempio etanolo, riduce la tossicità residua che può essere associata all'acetonitrile. Oltre a problemi di biocompatibilità, propanolo o miscele acetonitrile:propanolo spesso aumentano la solubilità di peptidi grandi o idrofobici e rompono gli aggregati che talvolta si formano in soluzione. L'effetto della miscela isopropanolo:acetonitrile 70%:30% sul peptide basico è mostrato nella Figura 12. La risoluzione del picco principale è migliorata rispetto ai suoi contaminanti a eluizione più stretta e il tempo di ritenzione è ridotto di circa la metà. In genere sono richieste temperature elevate della colonna con fasi mobili contenenti alcoli a causa della loro maggiore viscosità.

Ruolo del Modificatore di Fase Mobile

L'isolamento dei peptidi mediante cromatografia in fase inversa richiede l'aggiunta di un modificatore polare alla fase mobile poiché i peptidi hanno sia carica positiva (terminale amminico) sia carica negativa (terminale carbossilico) che riducono l'affinità per la superficie idrofobica del materiale di impaccamento. Anche i gruppi di protezione della catena laterale possono avere una carica, come mostrato nella Figura 13. I modificatori controllano il pH per modificare il grado di ionizzazione delle catene laterali debolmente acide o basiche. Il modificatore può anche formare coppie ioniche con il peptide. La separazione di un particolare campione può essere ottimizzata manipolando questi meccanismi.

L'acido formico abbassa il pH della fase mobile, protonando in tal modo le catene laterali acide sul peptide e rimuovendo parte della carica negativa (Figura 14). Il numero ridotto di catene laterali amminoacidiche cariche incrementa l'attrazione verso la superficie idrofobica della colonna, che favorisce una migliore separazione. Anche se la maggior parte dei silanoli presenti sulla superficie della colonna può essere protonata, sono comunque disponibili silanoli liberi per il legame con il peptide. Queste interazioni peptide-silanolo appaiono come picchi di scodamento nel cromatogramma.

L'acido trifluoroacetico (TFA), il modificatore più comunemente usato, differisce per il meccanismo di interazione con la colonna e il campione (Figura 15). Il pH basso protona le catene laterali di peptidi acide e l'accoppiamento ionico neutralizza le catene laterali basiche, inibendo il loro legame ai silanoli liberi che causano lo scodamento del picco. La combinazione di carica ridotta e accoppiamento ionico incrementa la ritenzione, richiedendo una concentrazione più elevata di solvente organico per l'eluizione.

Il vantaggio derivante dall'utilizzo di una colonna con particelle ibride a ponte di etile è l'eliminazione delle interazioni di silanolo (Figura 16). Il TFA non è più necessario per ridurre lo scodamento del picco, poiché l'impaccamento della base ha meno interazioni con il peptide. In alternativa, è possibile utilizzare acido formico (FA) o TFA per modificare la selettività della separazione mantenendo una buona forma del picco. La differenza di ritenzione e la modifica dell'ordine di eluizione possono essere utilizzate per regolare le condizioni di purificazione, come mostrato nella Figura 17. L'asterisco identifica lo stesso peptide contaminante nelle due separazioni, confermando la notevole e utile modifica della selettività.

Ruolo di pH Elevato

È anche possibile aumentare il pH per modificare l'interazione tra il peptide e la superficie della colonna ibrida a ponte di etile. Con tamponi come il bicarbonato di ammonio, il pH elevato deprotona e ionizza le catene laterali peptidiche acide (Figura 18). Il bicarbonato di ammonio deprotona e neutralizza anche le catene laterali peptidiche basiche, riducendo la carica del peptide e incrementandone l'attrazione verso la superficie idrofobica della colonna. Le catene laterali peptidiche basiche non si legano ai pochi silanoli residui e lo scodamento del picco è ridotto. Oltre a questi vantaggi, il bicarbonato di ammonio è volatile e relativamente facile da rimuovere dal prodotto peptidico purificato. Anche l'idrossido di ammonio allo 0,1% può essere utilizzato per elevare il pH della fase mobile e viene facilmente evaporato dalle frazioni raccolte.

I valori estremi del pH modificano la selettività delle separazioni (Figure 19 e 20). Il peptide acido (Figura 19) viene trattenuto meglio sull'impaccamento di fase inversa a pH basso perché tutte le cariche negative sono neutralizzate e il peptide interagisce fortemente con la superficie idrofobica della colonna. A pH elevato, invece, il peptide si sposta su un tempo di ritenzione anticipato a causa di un maggior numero di cariche negative, che gli impediscono di aderire altrettanto saldamente all'impaccamento della colonna. Per questo esempio, la forma del picco rimane inalterata, ma la modifica dell'ordine di eluizione potrebbe essere utilizzata nello sviluppo del metodo o per caratterizzare il peptide con una strategia ortogonale.

Come previsto, il peptide basico (Figura 20) mostra il comportamento opposto agli estremi del pH. A pH elevato i residui basici del peptide vengono deprotonati e non ionizzati. La forte interazione del peptide con la colonna richiede una percentuale più elevata di fase mobile organica per eluirlo dalla colonna. La modifica della selettività, con una migliore risoluzione a pH 10, rende il pH più elevato più allettante per l'obiettivo finale di isolamento di peptidi con maggiore purezza.

Promemoria: mentre le fasi mobili a pH alto e basso sono compatibili con le colonne con tecnologia a particelle ibride, le condizioni del metodo ai valori di pH estremi non devono essere utilizzate con impaccamenti di colonne a base di silice. Un pH troppo basso esegue il clivaggio della fase legata. Un pH elevato distrugge il substrato della colonna con particelle di silice. Verificare sempre i limiti dell'intervallo di pH consigliati dal produttore per specifiche colonne a base di silice.

Ruolo della Temperatura

Il controllo della temperatura viene spesso utilizzato in cromatografia per garantire separazioni riproducibili. Nelle tecniche di isolamento e purificazione, esso è utile per diverse ragioni aggiuntive. I peptidi idrofobici che presentano una solubilità limitata sono tra i campioni più difficili da purificare. L'innalzamento della temperatura di separazione incrementa la solubilità dei peptidi idrofobici e in genere migliora la forma del picco cromatografico. Ciò migliora in ultima analisi la purezza e il recupero dell'isolamento, rendendolo più rapido ed efficiente.

Poiché temperature diverse conferiscono una selettività cromatografica diversa, il riscaldamento della colonna è uno strumento molto conveniente per ottimizzare la separazione di un particolare campione. Inoltre, la viscosità della fase mobile e la pressione totale del sistema si riducono con l'aumento della temperatura. Una pressione più bassa riduce la tensione sul sistema, sui raccordi e sulla colonna e, in ultima analisi, aumenta la robustezza del funzionamento.

Mentre il controllo della temperatura in cromatografia analitica è di routine, la temperatura è impiegata raramente come parametro per la manipolazione della cromatografia su scala preparativa, per due ragioni. In primo luogo, le colonne di grande diametro non possono essere riscaldate in modo uniforme dall'esterno. In secondo luogo, le separazioni ad alta velocità di flusso avvengono alla temperatura del solvente in ingresso. Le coperte elettriche e i forni per colonne, sebbene soddisfacenti per le separazioni su piccola scala, non sono in grado di riscaldare in modo uniforme colonne di grandi dimensioni. Lungo il diametro e la lunghezza della colonna si formano gradienti di temperatura che incidono negativamente sulla cromatografia.

Per riscaldare efficacemente la colonna, inserire un loop di preriscaldamento del solvente in testa alla colonna e immergere completamente il loop e la colonna in un bagno d'acqua equilibrato alla temperatura desiderata (Figura 21). Il flusso continuo di solvente attraverso il loop di preriscaldamento porta la colonna all'equilibrio interno, mentre il bagno d'acqua stabilizza l'ambiente esterno della colonna. L'entità dell'allargamento di banda attribuito al loop di preriscaldamento del solvente è trascurabile perché è costruito con tubi di diametro interno stretto. Il campione in ingresso viene inoltre nuovamente focalizzato tramite adsorbimento sulla testa della colonna.

L'effetto dell'utilizzo del controllo della temperatura per le separazioni di peptidi è mostrato per due dei peptidi del pannello di test, il peptide basico (Figura 22) e il peptide acido (Figura 23). In questi esempi (evidenziati in rosso), i componenti del campione del peptide basico vengono separati meglio a 60 °C, mentre i componenti della miscela di peptidi grezzi acidi vengono risolti meglio a 40 °C. Tuttavia, queste osservazioni sono puramente casuali, poiché prevedere la temperatura ottimale per peptidi acidi o basici è pressoché impossibile e dipende dalle proprietà specifiche delle singole sequenze.

La modifica del solvente, del modificatore di fase mobile, del pH e della temperatura incide notevolmente sulle separazioni dei peptidi e ciascuno di questi parametri può essere utilizzato da solo o in combinazione con gli altri come strumenti di sviluppo di metodi per ottimizzare la cromatografia. Una colonna singola impaccata con particelle ibride stabili, come la tecnologia XBridge Peptide BEH Column, può semplificare il processo di purificazione riducendo il numero di colonne e il tempo di screening necessario per l'isolamento dei peptidi. La cromatografia del peptide basico nella Figura 24 illustra l'impatto che piccole modifiche hanno sulla separazione. Per quei peptidi con proprietà uniche, possono essere utili altre fasi stazionarie delle colonne per ottimizzarne la separazione.

Focalizzazione del Gradiente

Le separazioni cromatografiche per l'isolamento e la purificazione sono regolate dagli stessi principi fisici e chimici delle separazioni analitiche. Negli esperimenti di preparazione, tuttavia, gli scienziati isolano i composti a carichi di massa elevati, spesso su colonne di grandi dimensioni, che richiedono una risoluzione migliore per migliorare la purezza e il recupero del prodotto raccolto. La creazione di un gradiente basso è un buon primo approccio per migliorare la risoluzione, ma la modifica della pendenza del gradiente per l'intera separazione può provocare l'allargamento dei picchi e l'incremento del tempo di analisi totale. I gradienti segmentati e focalizzati diminuiscono la pendenza del gradiente solo per quella parte della separazione che richiede l'incremento della risoluzione, senza aumentare il tempo di analisi totale (Figure 25 e 26).

I gradienti lineari passano da una composizione organica bassa ad alta (ovvero 5–50%B o 5–95%B) nel corso di un periodo di tempo definito e sono spesso utilizzati per lo screening dei campioni. Possono essere impiegati anche per la cromatografia preparativa se è presente una buona risoluzione tra i componenti del campione e se il tempo di analisi è ragionevolmente breve. I gradienti segmentati mantengono la stessa pendenza prima e dopo la porzione meno profonda e focalizzata del metodo, preservando il profilo cromatografico per queste parti della separazione. La porzione più bassa e focalizzata del cromatogramma ha una pendenza del gradiente ridotta, che in pratica allontana dal picco di interesse le impurezze a eluizione ravvicinata.

I gradienti focalizzati hanno come target solo il prodotto. La forza del solvente aumenta rapidamente dalle basse concentrazioni utilizzate per il caricamento del campione a circa il 5% al di sotto del punto di eluizione previsto per il picco del prodotto. In generale, la parte più bassa del cromatogramma procede a circa un quinto della pendenza della separazione originale fino a circa il 3% al di sopra dell'eluizione prevista per il picco del prodotto. Una volta completata la porzione superficiale del gradiente, la percentuale di fase mobile organica viene rapidamente incrementata per lavare la colonna da eventuali contaminanti rimanenti. A causa della complessità delle miscele di peptidi, spesso la risoluzione migliore è vicina allo 0,25%–0,33% di sostituzione/volume di colonna, una pendenza leggermente inferiore rispetto al tipico quinto della pendenza del gradiente di screening originaria utilizzata per piccole molecole e campioni di peptidi meno complessi.

Il volume del sistema viene utilizzato nella progettazione del gradiente focalizzato, nonché nel ridimensionamento di base dalla scala analitica a quella preparativa. Il volume del sistema, chiamato anche volume di ritardo o volume di sosta, è definito come il volume dal punto di formazione del gradiente alla testa della colonna e include tutti i componenti del circuito idraulico HPLC, teste della pompa, smorzatori di impulsi, miscelatori, loop dell'iniettore e tubi. Nel ridimensionamento geometrico, in cui la pendenza viene preservata sia nella scala analitica che in quella preparativa, il volume del sistema impone un mantenimento isocratico prima che inizi il gradiente. Questo mantenimento può riguardare diversi volumi della colonna su piccola scala o una frazione di un volume della colonna su larga scala. Un mantenimento isocratico programmato alle condizioni iniziali viene utilizzato per compensare la differenza di volume del sistema tra la scala analitica e quella preparativa, garantendo così che il gradiente effettivo inizi esattamente nello stesso istante.

Utilizzando un gradiente a gradini (Tabella 3) in cui il solvente della fase mobile A è puro e il solvente della fase mobile B contiene un assorbitore UV appropriato (ovvero acetone a 2 mL/L), il volume del sistema può essere calcolato facilmente utilizzando la procedura e i calcoli illustrati nelle Figure 27 e 28.

Tabella 3. Gradienti a gradini per la determinazione analitica e preparativa del volume del sistema.

Sebbene sia possibile stimare il volume del sistema, il volume della colonna e la percentuale di solvente forte che eluisce il peptide e quindi creare il gradiente segmentato o focalizzato da queste stime per risparmiare tempo, vale la pena determinare sperimentalmente il volume del sistema e registrare questi valori per esperimenti successivi. Il volume del sistema rimane costante finché non vengono apportate modifiche al sistema idraulico HPLC e la velocità di flusso del metodo è identica alla velocità di flusso utilizzata per misurare il volume del sistema. Una volta determinato sperimentalmente il volume del sistema, le modifiche al sistema (come la modifica delle dimensioni del loop dell'iniettore) vengono calcolate facilmente e non richiedono ulteriori misurazioni del volume. Una volta determinato, il volume del sistema può essere utilizzato nei calcoli del gradiente focalizzato.

Progettazione del Gradiente Focalizzato

I gradienti focalizzati sono generalmente progettati in base all'analisi della miscela di campioni grezzi, ma la procedura è identica per la modifica di un gradiente che è già stato utilizzato in un'analisi preparativa iniziale. Utilizzando le equazioni mostrate di seguito, la creazione di un gradiente focalizzato è semplice. Supponiamo che il gradiente seguente sia quello da cui verrà designato il gradiente focalizzato: colonna di dimensioni 4,6 X 100 mm, volume del sistema 1,0 mL, volume della colonna 1,097 mL*
Tempo di ritenzione del picco = 7,76 min

*Il volume della colonna può essere determinato utilizzando un calcolatore disponibile sul web o utilizzando il volume di un cilindro: V = πr2h. I valori saranno leggermente diversi a seconda del metodo scelto, poiché alcuni calcolatori riducono il volume del liquido per tenere conto dell'impaccamento della colonna. Se viene utilizzato lo stesso metodo per tutti i calcoli, non vi è alcun impatto sulla cromatografia.

La Figura 29 mostra il cromatogramma del peptide di sintesi grezzo analizzato con questo gradiente.
Calcolare l'offset tra il punto di formazione del gradiente e il rivelatore

Offset = Volume del sistema + Volume della colonna

Esempio:
Offset = 1,0 mL + 1,097 mL
Offset = 2,097 mL
Calcolare il tempo necessario al solvente per raggiungere il rivelatore
Tempo al rivelatore = Offset in mL
Velocità di flusso in mL/min

Esempio:
Tempo al rivelatore = 2,097 mL/1,46 mL/min
Tempo al rivelatore = 1,43 min
 

Calcolare il tempo in cui si è formata la concentrazione di eluizione del picco

Tempo di concentrazione eluizione =
Tempo di ritenzione del picco - Tempo al rivelatore - Mantenimento del gradiente

Esempio:
Tempo di concentrazione eluizione = 7,76 min – 1,43 min – 0,00 min
Tempo di concentrazione eluizione = 6,33 min

Calcolare l'eluizione del picco %

% Concentrazione di eluizione =
Tempo concentrazione di eluizione / Lunghezza Pilota X Variazione Pilota /
Segmento di gradiente + % Gradiente pilota iniziale / Segmento di gradiente

Esempio:
% Concentrazione di eluizione = 6,33 min / 10 min X 45% + 5%
% Concentrazione di eluizione = 33,48%

NOTA: per tutti i calcoli relativi alle percentuali, utilizzare solo valori assoluti, ovvero 45 X 6,33 min, non 0,45 X 6,33.
 

Calcolare la pendenza del gradiente pilota in % di variazione per volume della colonna

N. Volumi della colonna (CV) =
1 CV X Velocità di flusso in mL X Tempo del segmento del gradiente X mL min

Esempio:
N. Volumi della colonna = 1 CV X 1,46 mL X 10 min / 1,097 mL min
N. Volumi della colonna = 13,3 CV

Esempio:
Pendenza del gradiente pilota = % di variazione del gradiente pilota
Pendenza del gradiente pilota = 45% / 13,3 CV = 3,38% / CV

Calcolare la pendenza del gradiente focalizzato in % di variazione per volume della colonna. Utilizzare un quinto della pendenza del gradiente pilota.

Pendenza del gradiente focalizzato in %/CV = 1/5 × Pendenza del gradiente pilota

Esempio:
Pendenza del gradiente focalizzato = 1 X 3,38% / 5 CV
Pendenza del gradiente focalizzato = 0,67% / CV

Creare un segmento di gradiente focalizzato da 5% inferiore fino a 3–5% superiore alla percentuale di eluizione stimata. Il picco eluisce al 33,5% di acetonitrile. Il gradiente basso deve variare da 28% a 36% di acetonitrile. Calcolare il tempo per il segmento del gradiente focalizzato.

Tempo per il segmento del gradiente focalizzato =
% di variazione X Pendenza del gradiente focalizzato X Volume della colonna X Velocità di flusso in mL

Esempio:
Tempo per il segmento del gradiente focalizzato =
8% X 1 CV / 0,67% X 1,097 mL / 1 CV X 1 min / 1,46 mL
Tempo per il segmento del gradiente focalizzato = 9,0 min
 

Scrivere il gradiente focalizzato a partire dalle condizioni iniziali dell'analisi pilota e con rampa rapida fino al 5% al di sotto della % di eluizione per il picco.

Il riquadro superiore della Figura 30 mostra il cromatogramma del peptide grezzo analizzato utilizzando il gradiente focalizzato. Le impurezze a eluizione ravvicinata vengono risolte meglio, ma con la riduzione della pendenza a circa un decimo della pendenza iniziale (riquadro inferiore) è stata ottenute la risoluzione migliore delle impurezze. Questo esempio illustra chiaramente l'impatto che la riduzione della pendenza a una variazione di 0,25–0,33% per volume della colonna può avere sulla separazione di una miscela peptidica complessa. Si noti che il tempo di ritenzione del picco del peptide principale è ancora di circa 7 minuti, approssimativamente lo stesso tempo del gradiente di screening originario. Focalizzando il gradiente, quindi, la risoluzione aumenta senza incrementare il tempo di analisi. Anche se il tempo di analisi complessivo per il gradiente totale è più lungo, è possibile utilizzare altre tecniche, come l'interruzione anticipata dell'analisi, per accelerare il processo di isolamento su scala più ampia. Questo peptide è stato infine isolato scalando geometricamente il gradiente focalizzato più basso.

Introduzione dei Campioni

Non esiste un solvente o una tecnica universale per dissolvere i peptidi di sintesi perché la composizione e la sequenza dei peptidi incidono direttamente sulla solubilità. Scelte utili per il solvente includono acqua con 0,1–2% di acido trifluoroacetico, acido formico o acido acetico, dimetilsolfossido, esafluoroisopropanolo, guanidina-HCl a 6–12 M, dimetilformammide, 0,1% di idrossido di ammonio o bicarbonato di ammonio a 10 mM. A volte i produttori forniscono indicazioni pratiche per la dissoluzione di diversi tipi di peptidi. La dissoluzione del peptide spesso comporta la formazione di un volume relativamente elevato di campione in un solvente forte.

Nei sistemi di cromatografia preparativa convenzionali (Figura 31), elevati volumi di iniezione di diluenti forti del campione spesso rendono distorto il cromatogramma, riducendo la quantità di prodotto che può essere isolato correttamente. All'aumentare del carico si perde la risoluzione delle impurezze a eluizione ravvicinata. La precipitazione del campione dovuta alla presenza di fase mobile acquosa su uno qualsiasi dei lati del campione nel loop o sulla testa della colonna riducono la robustezza del sistema e la durata della colonna.

Nelle separazioni convenzionali, un campione introdotto nella colonna in DMSO, o in un altro solvente forte, inizia immediatamente a viaggiare lungo la colonna, trasportando con sé le molecole del campione (Figura 32). Il campione non viene trattenuto fino a quando il solvente forte non viene diluito nella colonna. Sfortunatamente, quando le bande di campione rimangono sulla colonna, sono già larghe e migrano l'una nell'altra sul letto della colonna. Quando i componenti del campione eluiscono dalla colonna, le bande non sono distinte e la purezza di ciascun componente è scarsa.

La diluizione in colonna (ACD), una tecnica di iniezione alternativa, consente l'iniezione di grandi volumi di solventi forti e migliora contemporaneamente la solubilità del campione, il caricamento della colonna e la risoluzione. Con l'ACD, il sistema cromatografico è collegato in modo da diluire il campione in solvente forte nella testa della colonna con fase mobile acquosa (Figura 33). Il campione viene miscelato molto rapidamente e adsorbito sulla colonna. La velocità di trasferimento è così rapida da non consentire la precipitazione. Il solvente forte inizia immediatamente il lavaggio dalla colonna prima che inizi l'eluizione del campione.

Una volta avviato il gradiente, i componenti del campione eluiscono sotto forma di bande strette, a basso volume e a risoluzione netta (Figura 34).

La migliorata risoluzione tra i picchi dei componenti del campione consente di incrementare le dimensioni del campione e di ridurre quindi il numero di iniezioni necessarie per l'isolamento. In pratica, con la diluizione in colonna, il caricamento della colonna può essere incrementato da tre a cinque volte (Figura 42). La robustezza del sistema migliora con la diluizione in colonna, poiché la capacità del campione di precipitare nel loop o in corrispondenza della testa della colonna è limitata. L'incidenza degli arresti ad alta pressione è ridotta e la durata della colonna viene prolungata.

Esempio Pratico di Isolamento dei Peptidi

I principi della cromatografia di preparazione si applicano a tutti i tipi di molecole, inclusi i peptidi. L'esempio seguente illustra un flusso di lavoro tipico per l'isolamento di un peptide in un ambiente di ricerca e applica i fattori per l'ottimizzazione del metodo presentati in precedenza. La procedura può essere modificata a seconda dei requisiti di processo del laboratorio.

Il peptide utilizzato in questo esempio aveva una lunghezza di 17 amminoacidi con 3 residui basici, 2 acidi, 8 non polari e 4 polari. Il campione è stato disciolto in dimetilsolfossido, miscelato con il vortex e sonicato, quindi fatto passare attraverso un filtro per siringa Acrodisc GHP da 0,45 µm. La massa monoisotopica del peptide era 1772,9 Da e presentava i seguenti stati della carica:
[M+H]⁺ = 1773,9
[M+2H]²⁺ = 887,5
[M+3H]³⁺ = 592,2
[M+4H]⁴⁺ = 447,2

Profilo dei Peptidi Grezzi

Il campione peptidico grezzo è stato analizzato con due diversi modificatori (0,1% di acido formico e 0,1% di acido trifluoroacetico) nella fase mobile per determinare quale avrebbe fornito la migliore separazione. Mentre l'acetonitrile è più spesso utilizzato come componente organico della fase mobile, in questo esempio è stato utilizzato isopropanolo a scopo illustrativo. I risultati sono mostrati nella Figura 35, in cui il modificatore TFA (A e B) ha restituito un picco di prodotto più netto con contaminanti ben risolti rispetto all'acido formico (C e D), il tutto a 40 °C. La separazione è stata valutata anche a 25 °C e 60 °C, ma la forma e la risoluzione migliore dei picchi dei componenti del campione sono state ottenute a 40 °C (Figura 36). La temperatura leggermente elevata ha anche ridotto la contro-pressione del sistema attribuita all'isopropanolo come componente organico della fase mobile.

Focalizzazione del Gradiente

Dopo che il modificatore di fase mobile e la temperatura sono stati ottimizzati per l'analisi del grezzo, è stato utilizzato il gradiente focalizzato per migliorare la risoluzione dei picchi dei contaminanti a eluizione ravvicinata. La colonna da 4,6 × 50 mm aveva un volume di 0,698 mL e il volume del sistema è stato misurato a 0,77 mL. Il metodo HPLC utilizzato per l'analisi dei peptidi grezzi è mostrato di seguito:

Calcolare l'offset tra il punto di formazione del gradiente e il rivelatore

Offset = Volume del sistema + Volume della colonna

Esempio:
Offset = 0,77 mL + 0,698 mL
Offset = 1,468 mL
 

Calcolare il tempo necessario al solvente per raggiungere il rivelatore

Tempo al rivelatore =
Offset in mL / Velocità di flusso in mL/min

Esempio:
Tempo al rivelatore = 1,468 mL / 1,46 mL/min
Tempo al rivelatore = 1,00 min
 

Calcolare il tempo in cui si è formata la concentrazione di eluizione del picco

Tempo di concentrazione eluizione =
Tempo di ritenzione del picco - Tempo al rivelatore - Mantenimento del gradiente

Esempio:
Tempo di concentrazione eluizione = 3,23 min – 1,00 min – 0,50 min
Tempo di concentrazione eluizione = 1,73 min

Calcolare l'eluizione del picco %

% Concentrazione di eluizione =
Tempo do concentrazione eluizione / Lunghezza pilota X Variazione pilota / Segmento gradiente +
% Gradiente pilota iniziale / Segmento gradiente

Esempio:
% Concentrazione di eluizione = 1,73 min X 30% + 0% / 4,78 min
% Concentrazione di eluizione = 10,85%

NOTA: per tutti i calcoli relativi alle percentuali, utilizzare solo valori assoluti, ovvero 30 x 1,73 min, non 0,30 x 1,73.

Calcolare la pendenza del gradiente pilota in % di variazione per volume della colonna

N. Volumi della colonna (CV) =
1 CV X Velocità di flusso in mL X Tempo del segmento del gradiente X mL min

Esempio:
N. Volumi della colonna = 1 CV X 1,46 mL X 4,78 min / 0,698 mL min
N. Volumi della colonna = 9,99
Pendenza del gradiente pilota = % di variazione del gradiente pilota
N. volumi della colonna

Esempio:
Pendenza del gradiente pilota = 30% / 9,99 CV = 3,0% / CV

Calcolare la pendenza del gradiente focalizzato in % di variazione per volume della colonna. Utilizzare un quinto della pendenza del gradiente pilota.

Pendenza del gradiente focalizzato in %/CV =
1/5 X Pendenza del gradiente pilota

Esempio:
Pendenza del gradiente focalizzato = 1 X 3,0% / 5 CV
Pendenza del gradiente focalizzato = 0,6% / CV


Creare un segmento di gradiente focalizzato da 5% inferiore fino a 3–5% superiore alla percentuale di eluizione stimata. Il picco è eluito a 10,85% di acetonitrile; pertanto, il gradiente superficiale è stato progettato in modo da passare da 5–13% di acetonitrile in 6,37 min.

Tempo per il segmento di gradiente focalizzato =
% variazione X Pendenza gradiente focalizzato X Volume della colonna X Velocità di flusso in mL

Esempio:
Tempo per il segmento di gradiente focalizzato = 8% / 0,6% X 0,698 mL / 1 CV X 1 min / 1,46 mL
Tempo per il segmento di gradiente focalizzato = 6,37 min


Scrivere l gradiente focalizzato che parte alle condizioni iniziali dell'analisi pilota e con una rampa veloce a 5% in meno rispetto alla % di eluizione per picco.

Una volta creato il gradiente focalizzato, è stata valutata la separazione del campione peptidico grezzo (Figura 37A). Un piccolo picco di impurezza è eluito appena prima del picco del prodotto, ma era a malapena percettibile. Al doppio del carico (Figura 37B, 72 µg), l'impurezza era più visibile, ma il picco principale era ancora relativamente puro. Un carico quattro volte superiore a quello originario di 36 µg ha prodotto un cromatogramma in cui l'impurezza era più pronunciata e molto probabilmente ridurrebbe la probabilità di ottenere un prodotto puro se questo carico fosse geometricamente ridimensionato alla colonna più grande per la preparazione (Figura 37C). Con un carico di 256 µg sulla colonna analitica, l'impurezza è coeluita completamente con il picco principale (Figura 37D).

Ridimensionamento alla Preparazione

Il carico di 72 µg sulla colonna analitica è stato selezionato per il ridimensionamento geometrico per la preparazione. Questo carico conservativo incrementerebbe la probabilità di ottenere una quantità ragionevole di materiale puro con un numero inferiore di iniezioni rispetto al ridimensionamento del volume di iniezione più basso. Il carico di massa è proporzionale al volume della colonna e viene determinato utilizzando un calcolatore di preparazione o risolvendo M2 nella seguente equazione in cui:

M1 è il caricamento di massa sulla colonna 1 M2 è il caricamento di massa sulla colonna 2
L1 è la lunghezza e d1 è il diametro della colonna 1 L2 è la lunghezza e d2 è il diametro della colonna 2

M2 = M1 X L2 / L1 X d22 / d12
M2 = 72 μg X 100 mm / 50 mm X 19 mm2 / 4,6 mm2

M2 = 72 μg X 36 100 / 1058
M2 = 2456 μg o 2,4 mg

44,03 mg di peptide grezzo sono stati disciolti in 5 mL di DMSO e filtrati (concentrazione 8,80 mg/mL). Il ridimensionamento geometrico del carico di 72 µg sulla colonna analitica da 4,6 × 50 mm alla colonna preparativa da 19 × 100 ha richiesto un'iniezione di 2,4 mg, come calcolato in precedenza. Con una concentrazione di peptide grezzo di 8,80 mg/mL, il volume di iniezione è stato calcolato come segue:

Volume di iniezione = 2,4 mg X 1 mL / 8,80 mg/mL
Volume di iniezione = 0,272 mL o 272 μL

Il gradiente focalizzato analitico è stato ridimensionato per la preparazione, tenendo conto dei volumi del sistema su entrambe le scale (Tabella 4). Anche se il volume di sosta sembrava essere elevato per il sistema preparativo, questo includeva un loop di preriscaldamento da 5 mL per il riscaldamento della colonna, oltre a un loop di iniezione da 2 mL. Considerando questi contributi al volume del sistema, i 2,75 mL attribuibili ai rimanenti tubi del sistema erano abbastanza ragionevoli. Il picco del prodotto è stato raccolto in base al tempo (Figura 38).

Tabella 4. Ridimensionamento del gradiente.

• Colonna: 4,6 × 50 mm Colonna: 19 × 100 mm
• Volume di sosta del sistema: 0,77 mL Volume di sosta del sistema: 9,75 mL
• Volume della colonna: 0,698 mL Volume della colonna: 23,804 mL
• Volume di sosta del sistema (in volumi della colonna): 1,10 Volume di sosta del sistema (in volumi della colonna): 0,41 Offset del gradiente: 0,66

Analisi della Frazione

Il picco del prodotto peptidico è stato raccolto in due frazioni. Queste due frazioni erano molto pure, come mostrato nella Figura 39. L'ampio picco che è eluito a circa 2,25 minuti in ciascuna delle analisi delle frazioni e nel bianco deriva molto probabilmente dalla bassa concentrazione del modificatore acido trifluoroacetico per l'accoppiamento ionico nella fase mobile. I costituenti idrofobici nel TFA si accumulano comunemente sulla colonna e quindi eluiscono durante il gradiente. Il contaminante non proveniva da alcun componente del sistema, per esempio l'iniettore o la valvola, poiché un altro bianco senza colonna non mostrava picchi nel cromatogramma (Figura 40).

Diluizione in Colonna

Anche se il peptide è stato isolato con purezza elevata, l'incremento del carico di campione per iniezione migliorerebbe l'efficienza del processo e ridurrebbe il numero di analisi cromatografiche necessarie per purificare la quantità di prodotto richiesta per gli esperimenti successivi. Come discusso in precedenza, la diluizione in colonna gestisce in modo molto efficace carichi di campione più elevati con una semplice sostituzione dei tubi del sistema (Figura 33).

Anche se la velocità di variazione di %B per volume della colonna per l'isolamento dei peptidi utilizzando la diluizione in colonna era la stessa del metodo utilizzato per la separazione convenzionale in scala geometrica, la tabella del gradiente programmato è stata modificata in modo da includere il contributo del solvente organico introdotto dalla pompa ausiliaria di caricamento del campione (Tabella 5).

Tabella 5. Confronto tra gradienti: metodi convenzionali e di diluizione in colonna.

Tempo del gradiente: 14,40–1,66 = 12,74 min Tempo del gradiente: 16,00–3,26 = 12,74 min
Volume del gradiente: 12,74 min × 25 mL/min = 318,5 mL Volume del gradiente: 12,74 min × 25 mL/min = 318,5 mL
Volumi di colonna: 318,5 mL × 1 CV/23,804 mL = 13,38 CV Volumi di colonna: 318,5 mL × 1 CV/23,804 mL = 13,38 CV
Pendenza del gradiente: 8%/13,38 CV = 0,6%/CV Pendenza del gradiente: 8%/13,38 CV = 0,6%/CV
Velocità di flusso della pompa di caricamento durante il gradiente = 1,25 mL/min
1,25 mL/min = 5% del flusso totale
Velocità di flusso totale del metodo con gradiente = 25 mL/min

La pompa di diluizione in colonna introduce il solvente organico direttamente nel loop del campione ed è programmata in modo da funzionare al 5% della velocità di flusso totale. La velocità di flusso sulla pompa cromatografica viene pertanto ridotta da 25 mL/min nel metodo convenzionale a 23,75 mL/min nel metodo di diluizione in colonna. Si noti che la velocità di flusso totale è sempre di 25 mL/min (23,75 mL/min + 1,25 mL/min). Poiché la pompa di diluizione in colonna è collegata direttamente all'iniettore, all'inizio del gradiente viene inserito un passaggio di mantenimento, di durata sufficiente a garantire il trasferimento completo del campione dal loop alla colonna. Questo sistema è configurato con un loop da 2 mL e il passaggio di mantenimento originario era di 0,66 min.

Calcolare il passaggio di mantenimento per il metodo di diluizione in colonna: loop da 2 mL x (1 min/1,25 mL)=1,6 min
Passaggio di mantenimento pari a 1,60 min + 0,66 min dal metodo di preparazione originale = passaggio di mantenimento pari a 2,26 min per il metodo di diluizione in colonna.

Anche le percentuali di A e B del metodo del gradiente vengono modificate in modo da riflettere il contributo della pompa di diluizione in colonna. Il gradiente focalizzato inizia al 5%B e procede al 13%. Poiché il 5% del flusso totale viene erogato a una velocità di flusso costante di 1,25 mL/min di isopropanolo dalla pompa di diluizione in colonna, le percentuali di B nel metodo di diluizione in colonna sono programmate rispettivamente come 0% e 8%B. Si noti che, sebbene il metodo di diluizione in colonna sia programmato in modo leggermente diverso, il gradiente effettivo è identico al metodo convenzionale. Poiché questo peptide eluisce a una percentuale così bassa di B, il tempo effettivo trascorso al 5%B è più lungo nel metodo di diluizione in colonna, che incorpora il tempo necessario per passare da 0%B a 5%B nel metodo di preparazione convenzionale nel tempo di mantenimento nel metodo di diluizione in colonna. Queste due fasi sono programmate su righe separate nel metodo di diluizione in colonna per chiarezza per il lettore. Poiché le percentuali di B vengono diminuite per tenere conto del 5%B erogato dalla pompa di diluizione in colonna, le percentuali di A devono essere incrementate del 5% per mantenere il gradiente identico al metodo di iniezione convenzionale originario. Se il sistema cromatografico prevede passaggi di lavaggio nella sequenza di iniezione, assicurarsi che su tutte le linee di lavaggio sia stato eseguito il priming e che queste siano state riempite con un solvente di lavaggio forte.

Poiché l'isolamento su larga scala ridimensionato geometricamente è stato eseguito a 40 °C, è stata mantenuta la temperatura per l'iniezione utilizzando la diluizione in colonna. Il loop di preriscaldamento del solvente è stato inserito subito prima del raccordo a T nel flusso di solvente acquoso (Figura 41).

Il loop di preriscaldamento del solvente, il raccordo a T e la colonna sono stati quindi immersi nel bagno d'acqua. Prima di avviare la separazione in gradiente si è attesa la stabilizzazione della pressione, il che implicava il raggiungimento dell'equilibrazione del sistema. Mentre 2,4 mg di peptide era la quantità massima di campione che poteva essere iniettata utilizzando la configurazione idraulica convenzionale, una quantità cinque volte superiore, ovvero 12 mg (1,36 mL), è stata introdotta nella colonna con il sistema nella configurazione di diluizione in colonna (Figure 42 e 43). Le frazioni sono state raccolte in base al tempo e successivamente analizzate utilizzando il metodo di screening 0–30%B originario. Le frazioni hanno mostrato un'eccellente purezza ed erano paragonabili alle frazioni raccolte dalla preparazione che utilizzava la tecnica di iniezione convenzionale (Figura 44).

Considerazioni Speciali per i Peptidi Idrofobici

Un peptide idrofobico composto da residui amminoacidici non caricati, di cui 12 non polari e 3 polari, è stato disciolto in dimetilsolfossido. Il gradiente focalizzato preparativo riportato di seguito è stato utilizzato per l'isolamento su una colonna da 19 × 100 mm con il sistema cromatografico collegato per l'iniezione convenzionale. L'estrema idrofobicità del peptide ha richiesto l'utilizzo di una velocità di flusso ridotta, di un caricamento del campione inferiore e di una temperatura di 60 °C.

Anche se questo peptide è un buon candidato per l'utilizzo della diluizione in colonna, l'aumento del carico di massa sulla colonna comporta il rischio di precipitazione. Poiché il peptide eluisce a circa il 50% di acetonitrile, il caricamento di questo campione a 5%B (come nell'esempio precedente) è talmente inferiore alla forza di eluizione richiesta che il peptide è soggetto a precipitazione quando viene diluito in testa alla colonna. Aumentando la percentuale di solvente organico proveniente dalla pompa cromatografica durante il passaggio di caricamento si allevia il problema potenziale delle precipitazioni. In genere, nel caso di composti estremamente idrofobici, l'utilizzo di una percentuale iniziale di solvente organico nel metodo a gradiente di 20–25% inferiore rispetto alla percentuale di eluizione del composto prevista evita la precipitazione del campione, preservando al contempo i vantaggi della tecnica della diluizione in colonna. Il gradiente di diluizione in colonna modificato riportato di seguito è stato utilizzato per caricare un campione cinque volte più grande sulla colonna da 19 × 100 mm (Figura 45).

Il gradiente è stato avviato a 48%B (43,6%B + 5%B dalla pompa di diluizione in colonna) e si è concluso al 53% di acetonitrile in 29 minuti con una pendenza dello 0,49% di variazione per volume della colonna, in modo identico alla velocità di variazione del gradiente utilizzato per l'iniezione convenzionale. La pompa di diluizione in colonna ha portato il campione peptidico dal loop da 5 mL al raccordo a T in acetonitrile al 100%, dove ha incontrato la fase mobile della pompa cromatografica nella sua condizione iniziale, 23,6% B (18,6%B + 5%B dalla pompa di diluizione in colonna). Il tempo di mantenimento di 9,2 minuti all'inizio del metodo ha consentito di caricare completamente il campione nella colonna. La pompa di diluizione in colonna ha funzionato a una velocità di flusso costante di 0,8 mL/min, pari al 5% della velocità di flusso totale di 16,3 mL/min.

Tutte le colonne devono essere pulite occasionalmente, indipendentemente dal fatto che vengano utilizzate per separazioni di molecole piccole o grandi. Un'elevata contro-pressione, un elevato fondo cromatografico e picchi estranei che non possono essere attribuiti al campione sono tutte indicazioni della necessità di pulire la colonna.

Prevenire l'accumulo di contaminanti sulla colonna è il modo migliore per prolungare la durata della colonna. Si consiglia di filtrare tutti i campioni prima dell'iniezione. L'aggiunta di un filtro in linea o di una pre-colonna prima della colonna contribuisce a intrappolare il particolato e altri componenti indesiderati della miscela. Il lavaggio della colonna con due o tre volumi di colonna con un'alta percentuale di solvente organico dopo ogni separazione è utile per rimuovere sistematicamente i contaminanti indesiderati. Infine, la diluizione in colonna mantiene i campioni in soluzione, prevenendo un eventuale arresto ad alta pressione e facendo passare efficacemente i componenti del campione attraverso il sistema di purificazione, indipendentemente dal fatto che la loro destinazione finale sia una provetta di raccolta delle frazioni o il contenitore di scarico.

Un'elevata contro-pressione che si verifica improvvisamente è molto probabilmente dovuta alla precipitazione del campione in qualche punto del sistema: nel loop del campione, nei tubi, nella colonna o nella cella di flusso del rivelatore. Con il sistema cromatografico in funzione, allentando metodicamente i raccordi HPLC a partire dalla linea di scarico e risalendo verso le pompe, si isola completamente la sorgente dell'alta pressione. Un aumento graduale della contro-pressione è probabilmente il risultato dell'accumulo di impurezze sulla colonna dopo diverse iniezioni e può essere corretto in vari modi. L'esecuzione di gradienti rapidi ripetitivi a temperatura elevata, il lavaggio della colonna per un tempo prolungato in un'alta percentuale di solvente organico o l'iniezione di un "solvente di pulizia" come DMSO o acido formico all'1–10% possono essere utilizzati per rimuovere contaminanti indesiderati sulla colonna (Figura 46).

La depirogenazione, ossia la rimozione dalla colonna dei polisaccaridi endotossici che potrebbero contaminare il prodotto finale e indurre una reazione allergica, richiede in genere un lavaggio forte con idrossido di sodio 1 M per un'ora o più. Questa procedura non è compatibile con le colonne correnti.