Guida Completa all’Idrolisi e all’Analisi degli Amminoacidi

La workstation Eldex (Eldex Laboratories, Inc. 30 Executive Court Napa, CA 94558-6278 USA) Hydrolysis/Derivatization WorkStation (H/D WorkStation - in precedenza workstation Pico-Tag) è un’unità indipendente che fornisce un’idrolisi e un pre-trattamento affidabili e coerenti e derivatizzazione pre-colonna di campioni sottoposti ad analisi di amminoacidi. La workstation fornisce tutte le funzioni per l’idrolisi di proteine o peptidi in fase vapore.

In questa sezione sono descritte brevemente l’impostazione e il funzionamento della workstation. Per ulteriori informazioni, consultare il manuale della workstation Eldex.

L’unità richiede collegamenti per il vuoto e l’azoto.

La workstation contiene un matraccio Dewar e un cold finger. Il Dewar richiede ghiaccio secco.

I gruppi dei vial di reazione dell’unità possono contenere fino a 12 provette per campioni contemporaneamente.

• 6 N HCl con 1% in volume di fenolo
• Azoto (di grado pre-purificato)
• Metanolo
• Ghiaccio secco

1. Pulire le provette per campioni con un acido come 6 N HCl. Sciacquarli accuratamente con acqua e quindi con etanolo al 100% (non denaturato). Asciugarli sotto vuoto. Ai fini dell’identificazione, è possibile incidere le provette per campioni con una matita diamantata prima di inserirle nel vial di reazione.
2. Utilizzare una siringa o una micropipetta per inserire nelle provette per campioni una soluzione contenente 0,5-10 µg di campione. In un unico vial di reazione possono essere inserite fino a 12 provette. Le provette per campioni devono essere maneggiate con una pinza in Teflon o con guanti di plastica per evitare la contaminazione dovuta al contatto con la pelle.
3. Per consentire al forno di equilibrarsi, impostarlo sulla temperatura di 105 °C per 20-30 minuti prima di eseguire l’idrolisi.

1. Mettere del ghiaccio secco nel matraccio Dewar intorno al cold finger. Aggiungere con cautela metanolo o 2-propanolo nel dispositivo di intercettazione a freddo.
2. Accendere la pompa per vuoto.
3. Avvitare il tappo del vial di reazione sul vial. Far scorrere il pulsante sul tappo in posizione di apertura (ingresso verde).
4. Installare il vial di reazione sulla Workstation posizionando la parte superiore del vial nella porta per il vuoto e facendo scorrere il fondo del vial verso la Workstation sulla base nera.
5. Aprire la valvola del vuoto.
6. Una volta che il vacuometro raggiunge circa 65 millitorr, i campioni sono evaporati correttamente.
7. Per un’ulteriore asciugatura, attendere alcuni minuti su questa lettura.
8. Chiudere la valvola del vuoto e rimuovere il vial di reazione dalla Workstation. Svitare i tappi dal vial.
9. Aggiungere 200 µL di HCl/fenolo sul fondo del vial. Fare attenzione a non introdurre l’HCl direttamente nelle provette.
10. Con il tappo del vial di reazione in posizione di apertura (verde), avvitare il tappo sul vial e installare il vial sulla Workstation.

1. Verificare che la valvola dell’azoto sia chiusa e aprire con cautela la valvola del vuoto finché il vacuometro non indica circa 1-2 Torr e l’acido HCl inizia a produrre bolle. La procedura richiede circa 20-30 secondi.
2. Chiudere la valvola del vuoto.
3. Aprire la valvola dell’azoto e spurgare per cinque secondi. Chiudere la valvola dell’azoto.
4. Ripetere il ciclo dell’azoto sotto vuoto tre volte. Lasciare aperta la valvola del vuoto dopo l’ultimo ciclo.
5. Non far evaporare l’acido fino a secchezza. Se il vacuometro scende al di sotto di 500 millitorr, interrompere lo spurgo.

1. Mentre il vial è sotto vuoto, chiudere la valvola del tappo del vial (ingresso rosso).
2. Chiudere la valvola del vuoto e rimuovere il vial dalla Workstation.
3. Collocare il vial di reazione nel forno. Utilizzare guanti o pinze per evitare il contatto con l’interno del forno.
4. È ora possibile spegnere i sistemi del vuoto e dell’azoto della Workstation.

1. Trascorse le 20-24 ore, estrarre il vial dal forno per farlo raffreddare. Aprire la valvola del tappo del vial (ingresso verde). Rimuovere il tappo del vial di reazione e rimuovere con cautela le provette di campione con una pinza rivestita in Teflon. Utilizzare salviette da laboratorio per rimuovere l’HCl dall’esterno di ciascuna provetta.
2. Trasferire le provette del campione in un vial di reazione nuovo.
3. Avvitare il tappo del vial di reazione sul vial.
4. Aprire la valvola del tappo del vial (ingresso verde). Installare il vial di reazione sulla Workstation e aprire con cautela la valvola del vuoto.
5. Una volta che il vacuometro raggiunge circa 65 millitorr, i campioni sono evaporati correttamente.
6. Per un’ulteriore asciugatura, attendere alcuni minuti su questa lettura.