Guida Completa all’Idrolisi e all’Analisi degli Amminoacidi

L’analisi degli amminoacidi tramite cromatografia liquida e rivelazione ottica richiede un’ulteriore preparazione del campione, poiché la maggior parte degli amminoacidi è priva di cromoforo e non può essere rivelata. Pertanto, dopo l’idrolisi, il passaggio successivo dell’analisi degli amminoacidi è la derivatizzazione. In questa sezione è descritta la preparazione di idrolizzati proteici o peptidici per la derivatizzazione utilizzando la chimica Waters AccQ•Tag.

Per derivatizzare in modo corretto e affidabile un campione idrolizzato, è necessario considerare quanto segue:

• Rimozione di particolato
• Determinazione della massa del campione per la derivatizzazione
• Determinazione dell’eventuale necessità di neutralizzazione del campione
• Utilizzo di un eccesso di reagente di derivatizzazione in base alla massa del campione

Le discussioni che seguono sono abbreviate per necessità. Per ulteriori informazioni e linee guida sulla derivatizzazione con chimica AccQ•Tag, visitare il sito web www.waters.com/AAA

Potrebbe essere necessario sottoporre a centrifugazione l’idrolizzato se sono presenti ingenti quantità di particolato o lipidi surfattanti. La centrifugazione semplifica il prelievo di un’aliquota di idrolizzato trasparente per la derivatizzazione.

Per campioni di volume elevato come gli idrolizzati per l’analisi dei mangimi, la filtrazione del particolato può essere sufficiente, tenendo presente che il recupero dei campioni può essere influenzato dalla scelta del materiale del filtro. Questo fattore deve essere considerato e affrontato al fine di ottenere risultati privi di bias. Contattare il produttore del filtro per informazioni dettagliate sulle prestazioni del filtro in questa applicazione.

Il metodo AccQ•Tag è una tecnica di derivatizzazione pre-colonna per l’analisi degli amminoacidi di peptidi e proteine idrolizzati. Il metodo AccQ•Tag:

• Utilizza Waters i reagenti AccQ•Tag Ultra o AccQ•Fluor per derivatizzare gli amminoacidi
• Separa i derivati tramite HPLC o UPLC a fase inversa basati su gradiente
• Quantifica accuratamente i derivati utilizzando standard per amminoacidi esterni e rivelazione ottica

Il reagente 6-amminochinolil-N-idrossisuccinimidilcarbammato (AQC) reagisce sia con le ammine primarie che con quelle secondarie. Il reagente AQC in eccesso reagisce con l’acqua per formare 6-amminochinolina (AMQ). L’AMQ reagisce lentamente con l’eccesso di reagente AQC per formare una bis-urea. Questi prodotti secondari non interferiscono con la separazione, l’identificazione e la quantificazione degli amminoacidi contenuti in idrolizzati peptidi o proteici. I derivati sono stabili per giorni, consentendo il processamento in lotti o la ripetizione dell’analisi, se lo si desidera.

Nel corso degli anni sono stati eseguiti studi approfonditi per garantire l’accuratezza della reazione di derivatizzazione AccQ•Tag. La reazione chimica stessa richiede sia un eccesso molare del reagente di derivatizzazione che un pH basico (8-10) per la completa derivatizzazione di tutti gli amminoacidi. Sono state sviluppate strategie per affrontare questi fattori critici.

Nella reazione stessa il campione viene in genere diluito 10 volte e nella colonna viene iniettato in quantità di 1 µL su un volume totale di derivatizzazione di 100 µL. Poiché in una derivatizzazione non tutti gli amminoacidi sono presenti nella stessa quantità, la quantità di campione deve essere sufficiente affinché l’amminoacido meno abbondante incida sul limite di rivelazione o quantificazione. Per ottenere una quantificazione accurata si consiglia di derivatizzare almeno 1 pmol dell’amminoacido meno abbondante, in un volume di iniezione massimo di 1 µL. Per determinare la quantità di campione necessaria, eseguire il seguente calcolo:

Esempio di calcolo:
per una concentrazione di campione di 1,0 mg/mL di proteine:
stimare la quantità di campione necessaria per l’amminoacido meno abbondante. In questo esempio si presume che siano necessari 0,03 mg/mL per erogare 1 pmol su colonna di questo amminoacido.

Convertire mg in moli (il peso molecolare medio di un residuo amminoacidico in una proteina è pari a 110).

Questa è la concentrazione stimata dell’amminoacido meno abbondante in questo campione.

Ciò fornisce una diluizione di 27 volte (10 ÷ 0.37 = 27).

L’idrolizzato richiede una diluizione di 27 volte prima della derivatizzazione. Ad esempio: 5 µL di idrolizzato di campione possono essere diluiti con 135 µL di 0,1 N HCl per ottenere questo valore target.

Infine, un’aliquota da 10 µL della diluizione sopra indicata può essere trasferita nel vial di derivatizzazione.

Per garantire la completa derivatizzazione con il reagente AccQ•Tag degli amminoacidi contenuti nell’idrolizzato, il campione deve essere tamponato in un intervallo di pH approssimativo compreso tra 8,2 e 10,1. Se l’idrolizzato acido non è adeguatamente neutralizzato e il pH scende al di sotto di 8,2, la derivatizzazione sarà incompleta. L’effetto del pH varia per ciascun amminoacido. Si noti che non tutti gli amminoacidi sono interessati allo stesso modo. Gli amminoacidi acidi, come l’acido glutammico e l’alanina, subiscono un impatto maggiore rispetto alla serina o alla fenilalanina. Il pH è un fattore critico per ottenere una quantificazione accurata di tutti gli amminoacidi nel campione originale.

• Se la soluzione di amminoacidi viene disciolta in 0,1 N HCl, è possibile trasferire 10-20 µL di campione direttamente nel cocktail di derivatizzazione senza necessità di regolazione del pH. Nota: è ancora necessario per assicurarsi che il reagente disponibile per la derivatizzazione sia in eccesso, come descritto di seguito.
• Se la soluzione amminoacidica è in una concentrazione più elevata di acido (>0,1 N HCl), deve essere neutralizzata con un volume uguale di idrossido di sodio alla stessa concentrazione. Questa operazione può essere eseguita come aggiunta di volume di massa o integrata nella fase di derivatizzazione.
  • Sostituire la quantità richiesta di tampone borato con NaOH per neutralizzare l’HCl nel campione.
  • Nella miscela di vial di reazione di derivatizzazione, inserire 10 µL di xM NaOH e 60 µL di borato. Aggiungere 10 µL di campione AA (in xN HCl). Derivatizzare con 20 µL di reagente AccQ•Fluor.
• In caso di dubbi sulla corretta neutralizzazione, è possibile preparare campioni di prova e controllare il pH finale con strisce per pH monouso.

AVVERTENZA: se il campione diventa giallo vivo dopo l’aggiunta del reagente di derivatizzazione, il pH del campione è troppo basso. Neutralizzare con NaOH.

Esempio di calcolo:
per determinare la quantità di NaOH necessaria per la neutralizzazione, eseguire il seguente calcolo.
Per il suddetto campione di proteine a 1,0 mg/mL in 6 N HCl, che deve essere diluito di 27 volte per garantire che vi sia una quantità sufficiente di reagente di derivatizzazione in eccesso nel campione, si applicano i seguenti calcoli.

Convertire la concentrazione acida del campione da molare a µmoli:

Determinare la concentrazione finale di acido nel campione diluito:

Promemoria: 5 µL di idrolizzato di campione possono essere diluiti con 135 µL di 0,1 N HCl per ottenere questo valore target.

La quantità totale di NaOH necessaria per derivatizzazione è 0,31 M.

Poiché il tampone borato totale aggiunto alla derivatizzazione è di 70 µL, sono disponibili due metodi per la neutralizzazione:

Aggiungere 10 µL di NaOH 0,31 M e 60 µL di tampone per ogni derivatizzazione.

In un vial separato miscelare 600 µL di tampone borato e 100 µL di NaOH 0,31 M. Miscelare. Aggiungere 70 µL di questa miscela + 10 µL di campione + 20 µL di reagente di derivatizzazione AccQ•Tag per ciascun campione.

Per una derivatizzazione completa di tutti gli amminoacidi, nella reazione è necessario un eccesso molare di 4-6 volte il reagente di derivatizzazione AccQ•Tag. Se il reagente è insufficiente, alcuni amminoacidi relativamente sensibili non saranno completamente derivatizzati. Le velocità di derivatizzazione di ciascun amminoacido variano in base alle proprietà chimiche degli amminoacidi; ad esempio, il recupero di alanina può essere significativamente influenzato da un insufficiente eccesso molare di AccQ•Tag, mentre la fenilalanina è maggiormente immune a questi effetti.

Per determinare la quantità di campione da aggiungere al vial di reagente, è necessario conoscere la quantità di reagente presente in ciascun vial. Il vial di reagente AccQ•Tag contiene 3-4 mg di reagente equivalenti a circa 10-14 µmol di reagente. Poiché il reagente viene dissolto in 1 mL di acetonitrile e vengono utilizzati 20 µL per ogni reazione di derivatizzazione da 100 µL, ciascun recipiente di reazione contiene 210-280 nmoli di reagente di derivatizzazione.

Poiché ogni vial di reazione contiene 210-280 nmol di reagente e per ogni campione è necessario un eccesso molare di 4-6 volte, in ciascuna reazione devono esserci non meno di 40-140 nmol di ammine totali.

Esempio di calcolo:
per un campione proteico, utilizzare il peso del campione e il peso medio di un amminoacido per stimare l’eccesso richiesto.

Ad esempio, con una concentrazione proteica pari a 1 mg/ml e un peso molecolare medio di 110, la quantità di proteine nel campione viene determinata come segue:

in cui MW viene convertito in unità da g/mol a µg/µmol e

    1 mL = 103 µL

    1 mmol = 103 µmol = 106 nmol

Una volta determinata la concentrazione molare, viene calcolata la quantità di amminoacidi nel campione.

Utilizzando la proteina da 1 mg/mL nella fase 1, che ha richiesto una diluizione 27x (5 µL di idrolizzato madre + 135 µL di tampone) della sezione 6.3.1, le nmoli in 10 µL del campione diluito sono calcolate come segue:

3,3 nmol è ben al di sotto del limite di 140 nmol, quindi il campione è accettabile.

Il metodo HPLC AccQ•Tag, commercializzato da Waters Corporation nel 1992, utilizza la stessa fase di derivatizzazione pre-colonna del metodo AccQ•Tag Ultra introdotto nel 2006. Il reagente AccQ•Fluor, 6-amminochinolil-N-idrossisuccinimidilcarbammato (AQC), derivatizza le ammine primarie e secondarie in una semplice reazione a passaggio singolo per produrre addotti fluorescenti altamente stabili. Il metodo AccQ•Tag viene offerto come pacchetto di sistema che include reagenti preconfezionati e un’ampia documentazione. La confezione chimica dell’AccQ•Tag contiene gli elementi necessari per eseguire fino a 250 analisi di amminoacidi idrolizzati proteici e peptidici.

Il kit di derivatizzazione AccQ•Tag contiene cinque set di reagenti derivatizzanti. Ogni set di reagenti include un vial per ciascuno dei seguenti elementi:

• Tampone borato AccQ•Fluor: aggiunto ai campioni per garantire un pH ottimale per la derivatizzazione.
• Polvere reagente 6-amminochinolil-N-idrossisuccinimidilcarbammato AccQ•Fluor. Reagente derivatizzante (AQC) (fornito secco per la massima stabilità).
• Diluente per reagente AccQ•Fluor: acetonitrile, viene utilizzato per ricostituire il reagente per la derivatizzazione.

La soluzione Waters UPLC per l’analisi degli amminoacidi è progettata in modo olistico per eseguire analisi di amminoacidi chiavi in mano. Gli amminoacidi derivatizzati pre-colonna vengono risolti su un sistema Waters ACQUITY UPLC utilizzando AccQ•Tag Ultra, colonna a fase inversa, eluenti e metodi UPLC. La chimica di derivatizzazione robusta, le linee di base cromatografiche stabili e la risoluzione amminoacidica superiore consentono di ottenere risultati quantitativi accurati, precisi e coerenti.

La Soluzione per l’Analisi di Amminoacidi UPLC include:

• Forniture per prodotti chimici Waters AccQ•Tag Ultra, inclusi colonna, reagenti ed eluenti, tutti sottoposti a test QC con l’applicazione per l’analisi degli amminoacidi
• Progetti preconfigurati, metodi e formati di report del software Empower 2
• Documentazione di supporto completa a livello applicativo e di sistema

Il sistema Waters ACQUITY UPLC supporta tre diversi rivelatori ottici: UV regolabile, PDA e rivelatore di fluorescenza.

La soluzione per l’analisi di amminoacidi UPLC include due metodi completi che utilizzano la stessa strumentazione e le stesse chimiche. Il primo è adatto per gli amminoacidi derivati da idrolizzati proteici. Il secondo è adatto per il maggior numero di amminoacidi liberi presenti nei campioni di processo, come i brodi di coltura cellulare o di fermentazione. I metodi differiscono per la diluizione dell’eluente A AccQ•Tag Ultra e per la temperatura della colonna di separazione. Non vi sono regolazioni da parte dell’utente del pH o modifiche della composizione per l’eluente A o per l’eluente B.

L’analisi degli amminoacidi delle proteine viene utilizzata sia nell’ambito di una determinazione strutturale sia come misura della quantità totale di proteine in un campione. Il campione viene idrolizzato prima dell’analisi. Per le analisi strutturali, i rapporti molari osservati degli amminoacidi sono confrontati con i valori attesi dalla sequenza.

Per le quantità proteiche vengono sommati i pesi degli amminoacidi. Questa misura della concentrazione proteica viene utilizzata per calcolare i coefficienti di estinzione nei casi in cui la composizione del campione interferisce con i normali saggi proteici. Sia la percentuale in peso di ciascun amminoacido che la massa proteica totale vengono utilizzate per valutare il contenuto nutrizionale di alimenti e mangimi. La soluzione Waters per l’Analisi di Amminoacidi UPLC fornisce analisi di routine affidabili per tutte queste applicazioni.