Guida alla Cromatografia in Size Exclusion per Principianti

Per assegnare un peso molecolare a ogni intervallo di tempo di ritenzione per il polimero eluito, è necessario calibrare il nostro sistema o, più specificamente, il set di colonne. Esistono diversi modi per eseguire questa operazione, ma il più semplice consiste nell'utilizzare una calibrazione relativa basata su una serie di standard polimerici ben caratterizzati con una distribuzione del peso molecolare quanto più stretta possibile. L'ideale sarebbe utilizzare una serie di standard monodispersi, vale a dire a peso molecolare singolo, con il rapporto ponderale e il rapporto medio numerico (dispersità) pari a uno (Mw/Mn = 1).

Il massimo che si possa avvicinare a questo obiettivo è l'utilizzo di standard polimerici polimerizzati in modo specifico per questo scopo, per esempio gli standard monodispersi di polistirene a polimerizzazione anionica. Gli standard coprono un intervallo di pesi molecolari molto ampio, dai pesi monomerici a quelli molecolari >10 000 000, con una dispersione <1,10. Affinché uno standard di calibrazione sia effettivamente considerato monodisperso e accettabile per l'uso nella calibrazione GPC, la dispersione dovrebbe essere davvero <1,10. Esistono anche modi per eseguire una calibrazione con standard polidispersi ed è possibile utilizzare anche la procedura di calibrazione universale di Benoit (con o senza viscosimetro in linea). Tratteremo ciascuno di questi in dettaglio:

Calibrazione Relativa con Standard Monodispersi

Il metodo tradizionale di calibrazione con standard monodisperso è una calibrazione relativa, in quanto le medie ottenute dei pesi molecolari sono relative al calibrante. Per esempio, se si sta analizzando un campione di polietilene e la sequenza di colonne è stata calibrata con standard monodispersi di polistirene, i pesi molecolari ottenuti al termine dell'integrazione saranno basati sul polistirene e non saranno corretti per il polietilene. Ciò va bene per molte persone che, tuttavia, confrontano semplicemente i pesi molecolari ottenuti per un incognito con una serie di valori "accettabili". È irrilevante sapere se questi valori di peso molecolare siano "assoluti" per il polimero di interesse; l'importante è che essi siano ottenuti all'interno di un range accettabile.

Sono disponibili altri standard monodispersi per la GPC organica, per esempio poli(metilmetacrilati), poliisopreni, polibutadieni, poli(THF), ma sicuramente il polistirene è il principale standard monodisperso utilizzato per l'analisi GPC organica. Nel caso della GPC acquosa, gli ossidi poli(etilenici) sono i più utilizzati, insieme ai glicoli poli(etilenici) per il basso peso molecolare, e ai pullulani, che sono polisaccaridi basati su strutture triosiche. Dopo aver acquisito la serie di standard monodispersi viene eseguita una interpolazione polinomiale (in genere di terzo o quinto ordine) e viene tracciata la curva di calibrazione risultante che esprime log M in funzione del tempo di ritenzione (o del volume).

Calibrazione con Standard Polidispersi

La sequenza di colonne GPC può essere calibrata inoltre per mezzo di uno standard polidisperso che è lo stesso polimero analizzato come campione incognito. È possibile acquistare standard polidispersi da fornitori diversi; lo standard deve essere ben caratterizzato, vale a dire il numero, il peso, Z ed eventualmente i pesi molecolari medi della viscosità sono stati determinati con metodi alternativi (per esempio osmometria a membrana, light scattering, ultracentrifugazione). Un metodo alternativo consisterebbe nell'utilizzo di un "campione" di materiale reale (presente in quantità significativa), dove le medie di peso molecolare sono state determinate per mezzo di un metodo alternativo. Il vantaggio di ciò è la possibilità di utilizzare un polimero che ha la stessa struttura dei campioni incogniti analizzati giorno dopo giorno.

Le medie dei pesi molecolari note vengono inserite nel software e lo standard polidisperso viene cromatografato come di consueto, nelle stesse condizioni in cui verranno cromatografati gli incogniti. Il software esegue una routine di ricerca Simplex, adattando la forma dello standard polidisperso cromatografato alle medie di peso molecolare. La curva di calibrazione risultante sarà costituita dai punti di dati per ciascuna media. Se vengono forniti solo un numero e una media di peso, la curva di calibrazione risultante sarà composta da questi due punti e dal peso molecolare di picco oppure da una curva di calibrazione a tre punti. Questo standard polidisperso si basa sul lavoro svolto da Hamielec nel 1969. Si consiglia di utilizzare due standard polidispersi con pesi molecolari diversi per aumentare l'intervallo di peso molecolare della curva di calibrazione. Anche quando si utilizzano due standard polidispersi con due medie di peso molecolare conosciute, si ottiene solo una curva di calibrazione a sei punti (utilizzando i valori di peso molecolare di picco dai risultati della routine di ricerca). Tuttavia, per il laboratorio QC che analizza ogni giorno lo stesso polimero, con un intervallo di peso molecolare corrispondente a quello degli standard polidispersi, tale calibrazione è efficiente e fornisce pesi molecolari assoluti.

Sono disponibili altri standard monodispersi per la GPC organica, per esempio poli(metilmetacrilati), poliisopreni, polibutadieni, poli(THF), ma sicuramente il polistirene è il principale standard monodisperso utilizzato per l'analisi GPC organica. Nel caso della GPC acquosa, gli ossidi poli(etilenici) sono i più utilizzati, insieme ai glicoli poli(etilenici) per il basso peso molecolare, e ai pullulani, che sono polisaccaridi basati su strutture triosiche. Dopo aver acquisito la serie di standard monodispersi viene eseguita una interpolazione polinomiale (in genere di terzo o quindi ordine) e viene tracciata la curva di calibrazione risultante che esprime log M in funzione del tempo di ritenzione (o del volume).

Calibrazione Universale

Il concetto di calibrazione universale è stato introdotto da Benoit, et. al. nel 1967. Anziché tracciare il grafico del logaritmo del peso molecolare di una serie di standard monodispersi in funzione della ritenzione, viene tracciato il logaritmo del prodotto tra la viscosità intrinseca [η] e il peso molecolare M in funzione della ritenzione. Il prodotto [η]M è definito come volume idrodinamico. Benoit riscontrò che, tracciando una serie di valori volume idrodinamico per diversi standard monodispersi, si otteneva una singola curva di calibrazione. In altre parole, tutti i punti della stessa curva vengono interpolati. Una volta stabilita la calibrazione "universale", è possibile analizzare qualsiasi polimero con struttura random-coil nel solvente appropriato e determinare il peso molecolare in base alla curva universale. Benoit ha utilizzato un viscosimetro capillare in vetro per misurare la viscosità degli standard monodispersi e dei campioni. Una volta stabilita la curva universale, è altresì possibile tracciare il logaritmo della viscosità intrinseca in funzione del logaritmo del peso molecolare per gli standard monodispersi. Questo grafico è chiamato grafico teorico della viscosità o grafico di Mark-Houwink. La pendenza di questo grafico è alfa (a volte detta α) e l'intercetta è denominata log K. L'equazione risultante, nota come equazione di Mark-Houwink, è:

Nel documento Polymer Handbook sono riportati molti valori K e alfa di svariate combinazioni di polimero/solvente. È possibile inserire queste costanti empiriche in molti pacchetti software per GPC disponibili oggigiorno in commercio per ottenere i pesi molecolari accurati o "assoluti" di molti polimeri. Per evitare errori, assicurarsi che i valori del manuale siano accurati per il polimero da analizzare. 

Oggi è possibile utilizzare un rivelatore viscosimetrico in linea, unitamente al rivelatore a indice di rifrazione differenziale (dRI), per ottenere direttamente il peso molecolare di ciascuna porzione. Il dRI è il rivelatore di concentrazione (C), mentre il rivelatore viscosimetrico fornisce il prodotto tra viscosità intrinseca e concentrazione ([η]C). Dividendo il segnale del viscosimetro per il segnale dRI si ottiene la viscosità intrinseca [n i] di ciascuna porzione attraverso il picco del polimero. Conosciamo ora sia la viscosità intrinseca che, naturalmente, il tempo di ritenzione (o volume) di ciascuna porzione, quindi possiamo tornare alla curva di calibrazione universale e ottenere il peso molecolare di ciascuna porzione, Mi. Questo concetto di calibrazione universale ha un'ampia applicabilità, in particolare per i polimeri di tipo random-coil, che rappresentano la maggior parte dei polimeri analizzati oggigiorno. Altre conformazioni polimeriche, come bastoncini, sfere o forme globulari (come le proteine) potrebbero non comportarsi conformemente ai concetti di calibrazione universale. Affinché la calibrazione universale funzioni, non deve verificarsi alcuna interazione tra il polimero e l'eluente o il materiale di impaccamento della colonna.  

Un altro vantaggio dell'utilizzo della calibrazione universale e della rivelazione viscosimetria/dRI in linea è la capacità di determinare la ramificazione di un polimero rispetto a uno standard polimerico lineare noto. Questa tecnica è abbastanza sensibile alla ramificazione a catena lunga (al contrario della ramificazione a catena corta) ed è importante per prevedere come verrà processato un determinato polimero, o quali saranno le proprietà fisiche finali, rispetto alla controparte lineare. 

A titolo di esempio, è possibile analizzare un polimero lineare polietilenico (come "NBS 1475" o qualsiasi altro polietilene lineare noto), determinando i valori Mark-Houwink risultanti dall'esperimento. Il grafico di Mark-Houwink risultante (o grafico teorico della viscosità) sarà lineare, con pendenza costante (alfa sarà costante attraverso la distribuzione del peso molecolare). I valori K e alfa possono quindi essere inseriti nel software ed eventuali polietileni incogniti successivi possono essere analizzati confrontando il grafico teorico della viscosità con quello del polietilene lineare noto.

Se l'incognito presenta ramificazioni a catena lunga, la relazione viscosità/peso molecolare non è lineare; ciò significa che la viscosità non aumenta in modo lineare con il peso molecolare. Maggiore è questa deviazione dalla linearità, maggiore è il livello di ramificazione a catena lunga. Un valore alfa accurato può essere ottenuto per un polimero ramificato solo a bassi pesi molecolari, in assenza di ramificazioni a catena lunga e con pendenza costante. Una volta che il polimero ha raggiunto un peso molecolare tale da consentire una ramificazione a catena lunga, il valore alfa cambia continuamente (può anche avvicinarsi allo zero) e diventa privo di significato. Un semplice rapporto tra il grafico teorico della viscosità del polimero ramificato e quello del polimero lineare fornisce l'indice di ramificazione (g'), dove: g' = [η ]br/[η]lin Si possono fare ulteriori calcoli per determinare la frequenza di ramificazione, il tipo di ramificazione presente, ecc. È evidente che l'aggiunta in linea di un rivelatore viscosimetrico a un rivelatore dell'indice di rifrazione può fornire molte più informazioni sul polimero, in particolare:

• Pesi molecolari "assoluti" o accurati per il polimero tramite calibrazione universale
• Calcolo della viscosità intrinseca del polimero
• Determinazione della ramificazione

Esecuzione di un’Analisi GPC

Il criterio più importante per preparare un'analisi GPC è trovare un solvente adatto per dissolvere il polimero. Ciò può sembrare banale, ma ricordate che la GPC è una tecnica di separazione basata sulle dimensioni del polimero in soluzione. Le catene polimeriche si aprono in una certa conformazione rilassata in soluzione e il solvente scelto ne determina la dimensione. Molti polimeri sono solubili a temperatura ambiente in vari solventi, ma in alcuni casi (in particolare nel caso di polimeri altamente cristallini) è necessaria una temperatura elevata per la dissoluzione. Un altro aspetto importante per la preparazione dei campioni GPC è la concentrazione scelta. Se il caricamento della massa del campione sul set di colonne è eccessivo, potrebbero verificarsi effetti sulla concentrazione o sulla viscosità, che daranno luogo a volumi di eluizione errati. Un altro punto da considerare è se filtrare o meno la soluzione polimerica. Tratteremo alcune di queste considerazioni sulla preparazione dei campioni.

Si noti che in molti casi in cui è mostrato sodio nitrato, molti operatori hanno utilizzato acetato, solfato, cloruro di sodio, ecc. Si consiglia il sodio nitrato, che ha dimostrato di poter ridurre al minimo le interferenze ioniche in modo molto costante per i composti neutri e anionici. Il motivo di questi vari eluenti è dovuto alla carica anionica complessiva del materiale di impaccamento. L'impaccamento in gel a base di metacrilato per la GPC acquosa ha una carica complessiva anionica che può causare l'esclusione ionica per i campioni anionici e l'adsorbimento ionico per i campioni cationici se analizzati in sola acqua. 

Si dovrebbe sempre filtrare l'eluente sotto vuoto prima di utilizzarlo nel sistema cromatografico. Con i solventi organici si utilizza generalmente un filtro a fluorocarbonio. La dimensione della membrana dei pori del filtro è generalmente di 0,45 μm (micron). Per la GPC acquosa (filtrazione dell'acqua) si utilizza un filtro a membrana in acetato. Se si sta preparando un'analisi di light scattering, può essere una buona idea filtrare l'eluente attraverso un filtro da 0,20 μm. Alcuni solventi organici come il DMF sono molto viscosi e non bagnano molto bene la superficie del filtro a fluorocarbonio. Un buon consiglio consiste nel bagnare inizialmente la superficie del filtro con metanolo, quindi avviare rapidamente la filtrazione di DMF. Scartare quindi questo piccolo volume di miscela metanolo/DMF e avviare la filtrazione di DMF prima che il filtro si asciughi.

Concentrazione

Una volta scelto il solvente corretto per l'analisi, il passaggio successivo consiste nel preparare lo standard monodisperso e le soluzioni del campione. È necessario prestare attenzione a utilizzare una concentrazione sufficiente a ottenere un rapporto segnale/rumore accettabile, ma senza il rischio di sovraccaricare la colonna e di compromettere la concentrazione. La tabella che segue è una "regola pratica" generale da utilizzare come guida per la concentrazione da preparare. Queste concentrazioni sono espresse in percentuali, dove 1,0 mg/mL è pari allo 0,10%. Non viene eseguita alcuna correzione per la temperatura, quindi si presume che tutto sia stato preparato a temperatura ambiente. Tenere presente che se si eseguono analisi di viscosimetria o light scattering, è necessario determinare l'esatta massa iniettata. Ciò richiede correzioni di densità se l'analisi viene eseguita a temperatura elevata. Le concentrazioni indicate devono essere utilizzate presumendo un volume di iniezione massimo di 100 µL per colonna. 

Preparazione del campione

Quando sono stati disciolti correttamente gli standard e i campioni nel solvente scelto e sono state installate le colonne GPC, è possibile iniziare a eseguire le iniezioni. Successivamente bisogna scegliere se filtrare o meno la soluzione del campione. In quasi tutti i casi bisogna filtrare la soluzione del campione prima dell'iniezione.  

In genere, come nel caso della filtrazione del solvente discussa in precedenza, si sceglie un filtro al fluorocarbonio con membrana da 0,45 μm. In alcuni casi, in presenza di materiale particolato molto fine (come nerofumo, diossido di titanio, silice o altre cariche), è possibile utilizzare un filtro da 0,20 μm.  

Ovviamente, quando si inizia a utilizzare filtri di dimensioni molto fini, la sollecitazione da taglio sui polimeri può diventare un problema. Filtrare un polimero ad alto peso molecolare attraverso un filtro da 0,20 μm causerebbe sicuramente una degradazione dovuta a una sollecitazione da taglio. Potrebbe essere necessario scegliere di non filtrare affatto il campione e sperare che non vi sia alcun aumento di pressione dovuto all'ostruzione del filtro in linea del sistema o della fritta della colonna.  

Ora è possibile iniziare a eseguire le iniezioni degli standard e dei campioni. Come accennato in precedenza, inietteremo un massimo di 100 μL per colonna, alle concentrazioni indicate nella tabella. Il tempo di analisi sarà di circa 15 minuti per colonna a una velocità di flusso di 1,0 mL/min, quindi il tempo di analisi per una sequenza di tre colonne sarà di ~45 min.  

Una volta analizzata la sequenza di campioni, il sistema di gestione dei dati elabora i risultati in base al metodo di integrazione designato e fornisce un report completo. Questa operazione può essere eseguita automaticamente in modalità Run and Report (Analisi e report) nel software Empower, oppure è possibile scegliere di accedere a ciascun file di dati grezzi e integrare manualmente ciascun campione.