Guida all’UPLC per Principianti

Una miscela di campioni viene trasferita da un vial per campioni a un flusso di liquido in movimento (fase mobile). Il campione viene quindi trasportato dalla fase mobile fino alla testa di una colonna cromatografica da una pompa ad alta pressione. La fase mobile e la miscela di campioni iniettati entrano nella colonna, attraversano il letto di particelle per poi uscire trasferendo la miscela separata in un rivelatore (Figura 3).

In primo luogo, consideriamo come la banda del campione viene separata nelle singole bande di analiti (la direzione del flusso è rappresentata dalle frecce verdi). La Figura 4A rappresenta la colonna in corrispondenza del tempo zero (il momento dell’iniezione), quando il campione entra nella colonna e inizia a formare una banda. Il campione mostrato nell’esempio, una miscela di coloranti giallo, rosso e blu, appare come un’unica banda nera all’ingresso della colonna.

Dopo alcuni minuti, durante i quali la fase mobile scorre ininterrottamente e in maniera costante attraverso le particelle del materiale di impaccamento, è possibile osservare che i singoli coloranti si sono spostati in bande separate a velocità diverse (Figura 4B). Ciò è dovuto al fatto che esiste una competizione tra la fase mobile e la fase stazionaria per l’attrazione di ciascun colorante o analita. Si noti che la banda del colorante giallo si sposta più velocemente e sta per uscire dalla colonna. Il colorante giallo presenta una maggiore affinità nei confronti della fase mobile rispetto agli altri coloranti (ne è maggiormente attratto). Pertanto, si sposta a una velocità superiore, più simile a quella della fase mobile. La banda del colorante blu presenta una maggiore affinità nei confronti del materiale di impaccamento rispetto alla fase mobile. La sua maggiore attrazione per le particelle lo fa muovere molto più lentamente. In altre parole, è il composto maggiormente trattenuto in questa miscela di campioni. La banda del colorante rosso presenta un’attrazione intermedia nei confronti della fase mobile e si muove quindi a velocità intermedia attraverso la colonna. Poiché ogni banda di colorante si muove a una velocità diversa, è possibile separare cromatograficamente la miscela.

Come una banda cromatografica diventa un picco

Ogni singola banda dell’analita è costituita da molte molecole di analita. Il centro della banda contiene la più alta concentrazione di molecole di analita; mentre le parti anteriore e posteriore della banda presentano una concentrazione minore man mano che si interfacciano con la fase mobile (Figura 5).

Quando le bande di colorante separate escono dalla colonna, passano immediatamente al rivelatore. Il rivelatore vede (rivela) ciascuna banda dei composti separati su uno sfondo di fase mobile (vedere la Figura 6). Un rivelatore adeguato (UV, ELS, a fluorescenza, di massa…ecc.) è in grado di rivelare la presenza di un composto e di inviare il segnale elettrico corrispondente a una stazione di elaborazione dati, dove viene registrato come picco. Il rivelatore risponde alle variazioni di concentrazione delle specifiche molecole di analita all’interno della banda, la cui parte centrale (che presenta la popolazione maggiore di molecole di analita) viene interpretata dal rivelatore come apice del picco.

Cos’è un cromatogramma?

Un cromatogramma è una rappresentazione della separazione che ha avuto luogo dal punto di vista chimico (a livello cromatografico) nel sistema HPLC. Una serie di picchi che si alzano da una linea di base è tracciata su un asse del tempo. Ciascun picco rappresenta la risposta del rivelatore in relazione a un composto diverso. Il cromatogramma viene tracciato dalla stazione di elaborazione dati (vedere la Figura 6). La banda gialla ha attraversato completamente la cella di flusso del rivelatore; il segnale elettrico generato è stato inviato alla stazione di elaborazione dati. Il cromatogramma risultante inizia ad apparire sullo schermo. Si noti che il cromatogramma inizia quando il campione viene iniettato per la prima volta e appare inizialmente come una linea retta collocata nella parte inferiore dello schermo. Questa è definita “linea di base”; rappresenta la fase mobile pura che attraversa la cella di flusso nel corso del tempo. Quando la banda dell’analita gialla attraversa la cella di flusso, viene inviato un segnale (che varia a seconda della concentrazione delle molecole di analita) al computer. La linea curva, prima verso l’alto e quindi verso il basso, in proporzione alla concentrazione di colorante giallo nella banda del campione, creando un picco nel cromatogramma. Dopo che la banda gialla ha attraversato completamente la cella del rivelatore ed esce, il livello del segnale ritorna sulla linea di base; a questo punto, la cella di flusso contiene nuovamente solo fase mobile pura. Poiché la banda gialla si sposta più velocemente, eluendo per prima dalla colonna, costituisce il primo picco tracciato. Poco dopo, la banda rossa raggiunge la cella di flusso. Il segnale si alza dalla linea di base quando la banda rossa entra per la prima volta nella cella e inizia a tracciare il picco che rappresenta la banda rossa. In questo diagramma la banda rossa non ha attraversato completamente la cella di flusso. Il diagramma mostra come apparirebbe la banda/il picco rossi se il processo venisse interrotto in questo momento. Poiché la maggior parte della banda rossa ha attraversato la cella, la maggior parte del picco è stata tracciata, come mostrato dalla linea continua. Se si continuasse il processo cromatografico, la banda rossa attraverserebbe completamente la cella di flusso e il picco rosso risulterebbe completato (linea tratteggiata). La banda blu, con capacità di ritenzione maggiore, si sposta alla velocità più bassa ed eluisce dopo la banda rossa. La linea tratteggiata mostra come apparirebbe il cromatogramma completato se il processo di analisi si fosse concluso. È interessante notare che l’ampiezza del picco blu sarà la maggiore perché l’ampiezza della banda dell’analita blu, pur essendo più stretta sulla colonna, diventa la più ampia una volta che esce dalla colonna. Ciò è dovuto al fatto che si muove più lentamente attraverso il letto di materiale di impaccamento cromatografico e richiede più tempo (e volume della fase mobile) per essere eluito completamente. Poiché la fase mobile fluisce ininterrottamente a una velocità fissa, la banda blu si allarga ed è più diluita. Il rivelatore risponde in modo proporzionale alla concentrazione della banda, pertanto il picco blu presenta un’altezza inferiore e un’ampiezza maggiore.

Allargamento di banda

Prima che la banda del campione/analita raggiunga il rivelatore, attraverserà più componenti del sistema cromatografico, il che contribuirà alla distorsione e all’allargamento della banda cromatografica (Figura 7). Questo fenomeno è noto come allargamento di banda. Man mano che la banda dell’analita si allarga, l’ampiezza del picco cromatografico risultante aumenta. Una banda di maggiore ampiezza provoca un effetto di diluizione che produce una diminuzione dell’altezza del picco accompagnata da una perdita di sensibilità e risoluzione. Al contrario, se l’allargamento di banda viene minimizzato, si ottengono bande cromatografiche più strette, con conseguente aumento di efficienza. Questi picchi cromatografici più alti e stretti vengono rilevati con maggiore facilità dal rivelatore, consentendo di ottenere una maggiore sensibilità e risoluzione grazie a una banda dell’analita più concentrata. È quindi importante essere a conoscenza dei fattori che influenzano l’allargamento di banda nel tentativo di ridurre e controllare tali influenze al fine di migliorare il rendimento cromatografico complessivo.

In un sistema cromatografico, sia i fattori della colonna che i fattori extra-colonna (presenti al di fuori di essa) contribuiscono all’allargamento di banda. Tra i fattori extra-colonna vi sono il volume di iniezione, il percorso del fluido dello strumento tra l’iniettore del campione e la colonna e dall’uscita della colonna al rivelatore (inclusa la cella di flusso), nonché tutti i collegamenti presenti. I fattori della colonna comprendono la dimensione delle particelle del materiale di impaccamento, la qualità dell’impaccamento del materiale all’interno della colonna e le sue caratteristiche di diffusione in relazione alla velocità della fase mobile, le dimensioni e la geometria dell’analita. La somma delle varianze (σ2) per ciascuno di questi fattori incide sull’ampiezza di un picco (Figura 8).

Per ottenere prestazioni significativamente migliorate nell’ambito della cromatografia liquida, è necessario ridurre sia i fattori della colonna che i fattori extra colonna che influiscono sull’allargamento di banda. Il sistema ACQUITY UPLC si basa sul concetto di riduzione di entrambe le forme di allargamento di banda in modo da ottenere miglioramenti significativi in termini di efficienza e sensibilità (Figura 9).

Allargamento di banda extra-colonna (strumento)

Per ottenere un miglioramento significativo in termini di rendimento cromatografico, è stato compiuto uno sforzo tecnico sostanziale per progettare uno strumento LC in grado di adattarsi alle pressioni prodotte da impaccamenti di piccole particelle (inferiori a 2 µm), minimizzando al contempo la dispersione del circuito idraulico in modo tale da ottenere le prestazioni teoriche delle colonne per processi di separazione. È altrettanto importante che lo strumento analitico sia affidabile, robusto e preciso, destinato a un uso di routine in laboratorio. Per dimostrare l’importanza della progettazione dello strumento, è necessario comprendere il modo in cui la dispersione del sistema (allargamento di banda nella colonna e strumento) può influire sui risultati cromatografici.

La misura dei piatti teorici [N], o efficienza, tiene conto della dispersione di un picco. l’ampiezza di un picco è direttamente correlata all’ampiezza della banda dell’analita mentre attraversa il rivelatore, mentre l’apice di tale picco è il punto che presenta la massima concentrazione di molecole di analita all’interno di tale banda. Questa misura viene eseguita in condizioni isocratiche.

l’equazione del conteggio dei piatti teorici può essere ricavata come illustrato nella Figura 10, dove [Vn] rappresenta il volume di eluizione del picco, [w] l’ampiezza del picco e [a] una costante determinata in base all’altezza del picco in corrispondenza della quale viene misurata l’ampiezza del picco. Ciascun metodo di misurazione dell’ampiezza del picco produrrà risultati identici in termini di piatti teorici, purché il picco sia perfettamente simmetrico. Se il picco presenta fenomeni di “fronting” o “tailing”, questi metodi di misurazione produrranno risultati diversi.

È un errore comune pensare che i piatti teorici si riferiscano solo alle prestazioni ottenute dalla colonna stessa. Tuttavia, l’allargamento di banda sia dalla colonna che dallo strumento incide anche sull’ampiezza del picco a partire dalla quale vengono determinati i piatti teorici. Per dimostrare l’influenza dello strumento stesso sull’allargamento di banda, è stata utilizzata una singola colonna HPLC su due strumenti diversi: un HPLC standard (allargamento di banda = 7,2 µL) e un sistema ACQUITY UPLC (allargamento di banda = 2,8 µL). Poiché su entrambi i sistemi viene utilizzata la stessa colonna, il contributo della colonna nei confronti dell’allargamento di banda viene mantenuto costante. l’aumento di efficienza osservato sul sistema ACQUITY UPLC dimostra come uno strumento con una minore diffusione di banda genererà picchi di ampiezza inferiore, con conseguente aumento di piatti teorici (Figura 11).

Influenza della lunghezza e del diametro dei tubi

Una volta introdotta nel flusso, la banda del campione attraversa la colonna. Il sistema di gestione campioni ACQUITY UPLC è stato progettato per ridurre al minimo la distanza tra l’iniettore e l’ingresso della colonna al fine di minimizzare l’allargamento di banda. La colonna separa la banda del campione in singole bande di analiti. Quindi le bande di analiti separate cromatograficamente vengono trasferite dalla colonna al rivelatore. A prima vista, si potrebbe non considerare l’importanza del diametro interno (ID) del tubo che collega l’uscita della colonna e l’ingresso del rivelatore. Tuttavia, il diametro interno può influire notevolmente sull’allargamento di banda extra colonna (Figura 12).

Come prevedibile, l’allargamento di banda diminuisce con la riduzione del diametro interno del tubo. Facendo fluire una banda concentrata di analita in un tubo con diametro interno ampio, la concentrazione della banda diminuirà notevolmente, con conseguente generazione di un picco più ampio e distorto e una riduzione della sensibilità. Inoltre, l’attrito lungo le pareti del tubo fa sì che le molecole dell’analita a contatto con esse si muovano più lentamente rispetto alle molecole al centro del tubo, con conseguente distorsione del profilo della banda. La distanza tra il centro e la parte esterna della banda dell’analita si riduce al diminuire del diametro interno dei tubi. Ciò riduce il livello di distorsione nella banda. È altrettanto importante ridurre al minimo la lunghezza dei tubi, poiché lunghezze eccessive possono contribuire a distorcere la banda del campione.

Impatto delle impostazioni del rivelatore sull’allargamento di banda extra-colonna

Oltre ai contributi all’allargamento di banda basati sui fluidi dello strumento, anche le impostazioni del rivelatore digitale relative alla velocità di acquisizione e alla costante del filtro incidono sul risultato cromatografico. Ciò è particolarmente importante per le applicazioni UPLC, poiché l’ampiezza dei picchi è spesso molto ridotta [1-2 secondi] e il tempo di analisi può essere molto breve. Quando si imposta la velocità di acquisizione del rivelatore, la selezione deve basarsi sull’acquisizione di un numero sufficiente di data point in un picco per rappresentare correttamente il picco. Impostare una velocità troppo elevata del rivelatore influirà negativamente sul rapporto segnale-rumore provocando un aumento del rumore di fondo senza che ciò comporti un aumento dell’altezza del segnale dell’analita di interesse. Al contrario, impostare una velocità di acquisizione troppo lenta del rivelatore comporta l’ottenimento di data point inadeguati lungo il picco, riducendo così l’efficienza cromatografica osservata e compromettendo la capacità di effettuare una quantificazione riproducibile. Inoltre, viene utilizzata una costante temporale (filtro digitale) per appiattire i data point al fine di ottimizzare il rapporto segnale-rumore e può essere utilizzata unitamente o indipendentemente dalla velocità di acquisizione.

Le impostazioni del rivelatore diventano sempre più importanti man mano che l’ampiezza della banda dell’analita si restringe. Ciò richiede una velocità di acquisizione che non solo sia sufficientemente elevata da creare digitalmente un picco di tale velocità, ma anche da rendere correttamente la separazione ad alta risoluzione ottenuta nella colonna UPLC, qualora siano presenti picchi a eluizione ravvicinata.

A velocità di flusso inferiori, quando i picchi presentano una maggiore dispersione a livello temporale, queste impostazioni sono maggiormente tolleranti. Tuttavia, poiché l’ampiezza dei picchi si riduce e l’analisi si velocizza (come nelle separazioni UPLC), è necessario mantenere un’impostazione oculata della velocità di acquisizione e della costante temporale (Figura 13). Quando si utilizza la tecnologia UPLC per applicazioni “reali”, è consigliabile selezionare la velocità di acquisizione dei dati del rivelatore [Hz] che acquisisce accuratamente la forma del picco più stretto, quindi applicare una costante temporale del filtro (in secondi) che fornisce il rapporto segnale-rumore e la risoluzione ottimali per l’analisi.