Guida alla Cromatografia Liquida per Principianti

Nella Figura H, tre composti coloranti sono rappresentati nel cromatogramma da tre picchi separati nel tempo. Ciascuno di essi eluisce in una posizione specifica, misurata mediante il tempo trascorso tra il momento dell’iniezione [tempo zero] e l’ora di eluizione del picco massimo. Un cromatografo può riuscire a identificare ciascun composto confrontando il tempo di ritenzione di ciascun picco [t_R] con quello degli standard di riferimento iniettati nello stesso sistema cromatografico [stessa fase mobile e stazionaria].

Nel cromatogramma mostrato nella Figura I-1 il chimico analitico sapeva che, in tali condizioni del sistema LC, l’analita, l’acrilammide, si sarebbe separato ed eluito dalla colonna a 2,85 minuti [tempo di ritenzione]. Ogni volta che un nuovo campione, che conteneva acrilammide, veniva iniettato nel sistema LC alle stesse condizioni, sarebbe stato presente un picco a 2,85 minuti [vedere il Campione B nella Figura I-2].

[Per comprendere meglio il motivo per cui alcuni composti si muovono più lentamente [migliore ritenzione] di altri, consultare Modalità di Separazione HPLC].

Una volta stabilita l’identità, la successiva informazione importante è la quantità di ciascun composto presente nel campione. Il cromatogramma e i relativi dati provenienti dal rivelatore ci aiutano a calcolare la concentrazione di ciascun composto. Fondamentalmente, il rivelatore risponde alla concentrazione della banda di composto mentre attraversa la cella di flusso. Maggiore è la concentrazione, più forte è il segnale: viene visualizzata come una maggiore altezza del picco al di sopra della linea di base.

Nella Figura I-2, i cromatogrammi per i Campioni A e B, sulla stessa scala temporale, sono incolonnati uno sull’altro. Lo stesso volume di campione è stato iniettato in entrambe le analisi. Entrambi i cromatogrammi visualizzano un picco a un tempo di ritenzione [t_R] di 2,85 minuti, a indicare che ciascun campione contiene acrilammide. Tuttavia, il Campione A mostra un picco molto più grande per l’acrilammide. L’area al di sotto di un picco [conteggio dell’area del picco] è una misura della concentrazione del composto che rappresenta. Questo valore dell’area viene integrato e calcolato automaticamente dalla workstation del computer. In questo esempio, il picco dell’acrilammide per il Campione A ha un’area 10 volte superiore a quella del Campione B. Utilizzando gli standard di riferimento si può determinare che il Campione A contiene 10 picogrammi di acrilammide, ovvero dieci volte la quantità presente nel Campione B [1 picogrammo]. Da notare che è presente un altro picco [non identificato] che eluisce a 1,8 minuti in entrambi i campioni. Poiché i conteggi delle aree per questo picco in entrambi i campioni sono più o meno gli stessi, questo composto incognito potrebbe avere la stessa concentrazione in entrambi i campioni.

Funzionamento dei Sistemi LC Isocratici e a Gradiente

Le principali modalità di eluizione adottate nell’HPLC sono due: la prima è denominata eluizione isocratica. In questa modalità la fase mobile (solvente puro o miscela) rimane inalterata nel corso dell’intera analisi. La Figura J-1 illustra un sistema tipico.

Il secondo tipo è denominato eluizione a gradiente: come suggerisce il nome, la composizione della fase mobile varia durante la separazione. Questa modalità è utile per i campioni contenenti composti caratterizzati da un ampio spettro di polarità cromatografica [consultare la sezione relativa alle Modalità di Separazione HPLC]. Nel corso della separazione si aumenta la capacità di eluizione della fase mobile al fine di eluire i componenti del campione a forte ritenzione.

Nel caso più semplice illustrato nella Figura J-2, sono presenti due flaconi di solvente e due pompe. Il modulo di controllo del gradiente regola la velocità delle pompe per incrementare o diminuire la quantità di ciascun solvente erogata nel corso della separazione. I due flussi vengono combinati nel miscelatore per ottenere la composizione effettiva della fase mobile introdotta nella colonna durante l’analisi. All’inizio la fase mobile contiene una percentuale maggiore del solvente più debole [Solvente A]. Col procedere dell’analisi, si aumenta la percentuale del solvente più forte [Solvente B] in base a un profilo temporale predeterminato. Da notare che nella Figura J-2 il miscelatore si trova a valle delle pompe, quindi il gradiente viene creato ad alta pressione. Altri sistemi HPLC sono progettati per miscelare più flussi di solvente a bassa pressione a monte di un’unica pompa. Una valvola dosatrice del gradiente preleva i solventi dai quattro flaconi, modificando in tal modo la forza della fase mobile nel tempo [vedere la Figure J-3].

Scala HPLC [Analitica, Preparativa e di Processo]

Abbiamo parlato del modo in cui l’HPLC fornisce dati analitici che possono essere utilizzati sia per identificare che per quantificare i composti presenti in un campione. Tuttavia, l’HPLC può essere utilizzata anche per purificare e raccogliere le quantità desiderate di ciascun composto, utilizzando un raccoglitore di frazioni a valle della cella di flusso del rivelatore. Questo processo è denominato cromatografia preparativa [vedere la Figura K].

Nella cromatografia preparativa lo scienziato è in grado di raccogliere i singoli analiti mentre eluiscono dalla colonna [in questo esempio: giallo, poi rosso, poi blu].

Il raccoglitore di frazioni raccoglie in modo selettivo l’eluito che ora contiene un analita purificato, per un periodo specificato. I recipienti vengono spostati in modo che ciascuno raccolga un solo picco dell’analita.

Uno scienziato determina gli obiettivi per il livello di purezza e la quantità. Questi obiettivi, unitamente alla conoscenza della complessità del campione e della natura e concentrazione degli analiti desiderati rispetto ai componenti della matrice, a loro volta determinano la quantità di campione da processare e la capacità richiesta del sistema HPLC. In genere, con l’aumentare delle dimensioni del campione, aumenteranno anche le dimensioni della colonna HPLC e la pompa necessiterà di una maggiore capacità di velocità di flusso in volume. La determinazione della capacità di un sistema HPLC viene denominata selezione della scala HPLC. Nella Tabella A sono elencate varie scale HPLC e i relativi obiettivi cromatografici.

La capacità di massimizzare la selettività con una combinazione specifica di fasi stazionarie e mobili per l’HPLC, ottenendo la massima separazione possibile tra due componenti del campione di interesse, è fondamentale per determinare i requisiti per l’aumento di una separazione [vedere la sezione che tratta le Modalità di Separazione HPLC]. La capacità diventa quindi una questione legata all’aumento del volume della colonna [V_c] rispetto alla quantità di campione da iniettare e alla scelta di una dimensione delle particelle appropriata [determina la pressione e l’efficienza; vedere la sezione che tratta la Forza di Separazione]. Il volume della colonna, in funzione della lunghezza del letto [L] e del diametro interno [i.d.], determina la quantità di materiale di impaccamento [particelle] che può essere contenuto (vedere la Figura L).

In generale, le colonne HPLC hanno lunghezza compresa tra 20 mm e 500 mm [L] e diametro interno [i.d.] tra 1 mm e 100 mm. All’aumentare della scala cromatografica aumentano anche le dimensioni delle colonne, in particolare la sezione trasversale. Per ottimizzare la produttività, le velocità di flusso della fase mobile devono incrementare in misura proporzionale alla sezione trasversale. Se si desidera ottenere una dimensione delle particelle più piccola per ottenere una forza di separazione maggiore, le pompe devono essere progettate per supportare velocità di flusso del volume della fase mobile più elevate a un’alta contro-pressione. La Tabella B presenta alcune semplici linee guida sulla selezione del diametro interno della colonna e dell’intervallo di dimensioni delle particelle consigliato per ciascuna scala cromatografica.

Per esempio, un’applicazione in scala semi-preparativa [X rossa] userebbe una colonna con un diametro interno di 10-40 mm contenente particelle da 5-15 micron. La lunghezza della colonna può quindi essere calcolata in base alla quantità di composto purificato da processare durante ogni analisi e alla forza di separazione richiesta.