Guida alla Cromatografia Convergente per Principianti

In questo capitolo si esamina innanzitutto la terminologia utilizzata nella CC, quindi si descrivono i tipi di campioni e analiti candidati per l’analisi da parte del sistema ACQUITY UPC². Viene illustrato il ruolo di co-solventi, additivi della fase mobile e diluenti dei campioni, nonché gli effetti della pressione e della temperatura sulla densità, con conseguenti effetti anche sulle separazioni. Infine, viene introdotto un protocollo generico per lo sviluppo di un metodo.

Terminologia

Come descritto in precedenza, la CC è simile all’RPLC, ma sostituisce la CO₂ compressa al solvente debole (fase mobile A) anziché all’acqua. Tutti i termini convenzionali come solvente, co-solvente o modificatore si riferiscono ai componenti liquidi primari della fase mobile B, il solvente di eluizione forte. In genere, nella CC il co-solvente è il metanolo, ma possono essere anche altri solventi organici come l’etanolo, l’alcool isopropilico, l’acetonitrile o loro combinazioni. Un additivo è un sale o un liquido aggiunto al co-solvente a una bassa concentrazione per migliorare la forma del picco e/o la solubilità dell’analita. L’additivo può influenzare anche la selettività cromatografica. Gli additivi tipici includono la dietilamina, l’idrossido di ammonio, l’acido formico, l’acido trifluoroacetico, il formiato di ammonio, l’acetato di ammonio o piccole quantità d’acqua. La concentrazione appropriata dipende dall’additivo: per esempio, l’aggiunta d’acqua a valori superiori al 5% comporta il rischio della formazione di una fase mobile bifasica se le altre condizioni del metodo non vengono scelte in modo appropriato.

Una delle prime domande che viene posta su una nuova metodologia analitica è: “Posso analizzare il mio campione con questa tecnica (cromatografia convergente)?” La risposta più semplice è: se il campione può essere dissolto in un solvente organico, è un candidato per la CC. Non esiste una risposta universale a questa domanda ed è necessario un certo lavoro sperimentale per dare la conferma. Questa compatibilità con i solventi organici iniettabili è molto vantaggiosa poiché molte tecniche di preparazione dei campioni producono campioni in solvente organico (per esempio, l’estrazione liquido/liquido, l’estrazione in fase solida, la precipitazione proteica). Il vantaggio della CC è che questi campioni in un solvente organico possono essere iniettati direttamente nel sistema ACQUITY UPC² e non richiedono i lunghi e laboriosi step di evaporazione o ricostituzione spesso necessari per l’RPLC. Il capitolo 5 tratta questo argomento in modo più dettagliato. Per l’analista è sempre utile apprendere quanto più possibile su un campione (Figura 23): più si conosce, maggiori sono le possibilità di sviluppare un metodo robusto. Un’informazione utile relativa alla solubilità dei composti in vari solventi organici riguarda il coefficiente di partizione (P) (in genere indicato come log₁₀ P). Il coefficiente di partizione (P) è il rapporto tra le concentrazioni di un composto nelle due fasi di una miscela di due solventi immiscibili in equilibrio, in genere acqua e 1-ottanolo (Figura 24). Questi coefficienti sono una misura della solubilità differenziale del composto tra questi due solventi. Il coefficiente di partizione misura quanto sia idrofilo o idrofobico un composto.

In termini di CC, il coefficiente di partizione potrebbe aiutare a determinare se un composto target è un candidato per l’analisi da parte del sistema ACQUITY UPC². Come regola generale, composti con valori di log P compresi tra 2 e 9 sono candidati idonei per la CC.

Co-Solventi nella Cromatografia Convergente

Il co-solvente ha due ruoli. In primo luogo, influenza il potere di solvatazione della CO₂. In secondo luogo, influenza l’interazione tra l’analita e la fase stazionaria. La modifica del co-solvente (per esempio, da metanolo ad acetonitrile) influisce sia sulla ritenzione che sulla selettività. Il ruolo del co-solvente nella CC è analogo a quello del solvente forte nella LC in fase inversa; la CO₂ da sola ha indicativamente la forza di eluizione dell’eptano.

La Tabella 1 presente nel capitolo 1 mostra la serie eluotropica (forza eluente) per una serie di solventi organici ed evidenzia i quattro co-solventi più comuni utilizzati nella CC: acetonitrile, alcool isopropilico, etanolo e metanolo. Tutti i solventi elencati sono miscibili con la CO₂, il che comporta un’ampia gamma di forze di eluizione e di ritenzione disponibili.

I co-solventi aggiunti alla fase mobile della CO₂ in genere riducono il tempo di ritenzione di un analita. Con l’incrementare della concentrazione del co-solvente, la polarità della fase mobile cambia, diminuendo i tempi di ritenzione. La Figura 25 illustra l’effetto della variazione della concentrazione del co-solvente sulla ritenzione di una separazione isocratica. Quando diminuisce la concentrazione del co-solvente forte (metanolo) di eluizione, incrementa la ritenzione degli analiti. È lo stesso fenomeno osservato nell’RPLC.

La Figura 26 dimostra la variazione di forza della fase mobile con diversi co-solventi. Il metanolo è il co-solvente più forte ed eluisce gli analiti più rapidamente. L’alcol isopropilico è più debole del metanolo, ma più forte dell’acetonitrile, mentre l’acetonitrile è il più debole dei tre co-solventi nella CC e trattiene gli analiti più a lungo. Lo stesso tipo di comportamento cromatografico relativo si verifica in altre modalità di cromatografia; i solventi più forti riducono la ritenzione ed eluiscono gli analiti più rapidamente.

Nella CC si possono miscelare co-solventi diversi per modificare la forza del solvente e creare differenze di ritenzione. La Figura 27 illustra l’effetto dell’aggiunta di un co-solvente più debole (acetonitrile) al metanolo, per una separazione in gradiente del metoclopramide e delle impurezze correlate. All’incrementare della concentrazione dell’acetonitrile, la concentrazione di metanolo e quindi la forza del solvente diminuiscono, osservando tempi di ritenzione più lunghi. In questa separazione, con un co-solvente diverso la selettività varia leggermente, la risoluzione migliora e aumenta la nitidezza dei picchi.

Additivi nella Cromatografia Convergente

Come nell’RPLC, gli additivi della CC migliorano la forma del picco e/o la risoluzione della separazione. Nella Figura 27 sono mostrati gli effetti dell’aggiunta di formiato di ammonio a tutte le miscele di co-solventi per tutti e quattro i cromatogrammi. Gli additivi possono modificare la superficie della fase stazionaria o agire come coppie ioniche, modificando la selettività. Gli additivi basici tendono a migliorare la forma del picco per i composti basici e potrebbero modificare leggermente la selettività. Esempi di additivi basici includono l’idrossido di ammonio, la 2-propilammina e la trietilammina. Gli additivi acidi possono migliorare la forma del picco per i composti acidi e potrebbero modificare la selettività. Gli additivi acidi comuni includono l’acido trifluoroacetico, l’acido formico e l’acido acetico. La Figura 28 mostra una separazione di analiti acidi e, come mostrato in questo esempio, l’incremento della concentrazione dell’additivo acido migliora la forma del picco.

Il passaggio da un additivo all’altro può influire drasticamente sulla ritenzione e sulla forma del picco (Figura 29). Per questi analiti basici (beta-bloccanti), il metanolo come co-solvente senza additivi dà luogo a picchi di forma inadeguata. L’aggiunta di acido formico in realtà peggiora la forma del picco. Inoltre, si ha l’assorbanza dell’acido formico alla lunghezza d’onda di rivelazione di 220 nm, con una conseguente linea di base inclinata. Per queste basi forti, l’aggiunta di acetato di ammonio (20 mM) migliora notevolmente la forma del picco, allo stesso modo della dietilamina, poiché la forma del picco dei composti basici spesso migliora quando si utilizzano degli additivi basici.

Diluenti del Campione nella Cromatografia Convergente

Anche se molti diluenti dei campioni sono compatibili con la CC, a volte è necessario selezionare il diluente corretto per ottenere la forma del picco migliore. L’intensità del diluente del campione può influire notevolmente sulla forma del picco e sulla solubilità nella CC. Come per altre modalità di cromatografia, è consigliabile un diluente debole (il più debole possibile) per il campione, bilanciando la solubilità dell’analita e la forma del picco. Nella caso della CC, significa che il campione deve essere dissolto in un solvente organico vicino alla parte superiore della serie eluotropica (Tabella 1). Waters consiglia l’eptano/2-propanolo (90:10) come buon solvente generico, in quanto equilibra la solubilità (alcool isopropilico) e la forma del picco (eptano). Il contenuto d’acqua nel campione deve essere ridotto o eliminato, se possibile. La Figura 30 mostra sette cromatogrammi sovrapposti di picchi per il composto neutro di butilparabene. All’incrementare del volume di iniezione, si manifestano gli effetti della forza del solvente iniettabile sulla forma del picco. Nel caso del metanolo come co-solvente forte, si verifica il fronting del picco all’incrementare del volume di iniezione. L’alcool isopropilico più debole mostra un fronting minore e picchi leggermente più alti rispetto al metanolo. Il diluente alcol isopropilico/esano consigliato per il campione fornisce picchi netti e simmetrici per tutti i volumi di iniezione.

Pressione, Temperatura e Densità

L’impostazione del regolatore di contro-pressione automatizzato (ABPR) incide sul tempo di ritenzione modificando la densità della CO₂ compressa. All’incrementare dell’impostazione della pressione dell’ABPR, la densità incrementa mentre i tempi di ritenzione diminuiscono. Nonostante la composizione della fase mobile abbia l’effetto maggiore sulla separazione, la regolazione della pressione e della densità della fase mobile possono consentire di regolare un metodo con estrema precisione. La Figura 31 mostra che, incrementando l’impostazione dell’ABPR (pressione), lasciando invariati tutti gli altri parametri, si riducono i tempi di ritenzione.

 Come nel caso dell’RPLC, la temperatura della colonna influisce sia sulla selettività che sulla ritenzione nella CC e i diversi analiti ne risentono in misura diversa. L’incremento della temperatura della colonna incrementa l’energia delle molecole dell’analita, il che, come accade nell’LC o nella GC, deve portare a una riduzione della ritenzione sulle fasi stazionarie. Tuttavia nella CC, l’incremento della temperatura a una pressione costante diminuisce anche la densità della fase mobile, che riduce il suo potere di solvatazione, portando quindi a una maggiore ritenzione. Pertanto, nella CC, la variazione della temperatura ha un effetto contrario. Per lo più, all’incrementare della temperatura della colonna, la densità della fase mobile diminuisce e i tempi di ritenzione incrementano (Figura 32). Inoltre, notare la presenza di un ulteriore picco (piccolo) a 50 °C, che deriva da leggere differenze di selettività poiché la temperatura influisce in modi diversi sui vari analiti.

La forma del picco, la ritenzione e la selettività vengono manipolate variando e comprendendo i ruoli di elementi quali il co-solvente, l’additivo, il diluente del campione, la pressione, la temperatura e la fase stazionaria. Combinando quanto illustrato nel presente capitolo, la Tabella 5 mostra come ottimizzare le separazioni CC utilizzando questi strumenti. Tuttavia, va notato che l’importanza di ciascun parametro potrebbe variare per una data separazione. Per esempio, a volte la fase stazionaria svolge un ruolo più importante della scelta del co-solvente nella manipolazione della selettività. In altre situazioni, il passaggio dal metanolo al metanolo/acetonitrile (50:50) svolge un ruolo più importante rispetto al cambio delle fasi stazionarie delle colonne.

Protocollo Generico di Sviluppo del Metodo - Approccio 1

Nella Figura 33 è descritto un protocollo per determinare rapidamente se un campione può essere dissolto in un solvente iniettabile compatibile con la CC. Se il log P dell’analita ha un valore compreso tra -2 e 9, è possibile farlo. Se è inferiore a -2, l’analita è solubile solo in un solvente acquoso e pertanto potrebbe non essere compatibile con la CC. Se il valore log P dell’analita è incognito, va dissolto in un solvente organico adeguato prima dell’iniezione. Tenere presente che la cromatografia convergente si comporta più come una separazione in fase diretta, in cui i solventi come il metanolo sono molto forti (l’opposto della LC in fase inversa, in cui è un solvente abbastanza debole).

Di conseguenza, il campione deve essere dissolto (o diluito) in un solvente più debole come l’eptano/alcool isopropilico. È necessario trovare un equilibrio tra solubilità del campione e forma del picco; in precedenza in questo capitolo si è parlato dell’effetto del diluente del campione sulla forma del picco nella CC.

Oltre alla selezione di un diluente del campione, lo sviluppo di un metodo richiede altre considerazioni. Per esempio, quali condizioni cromatografiche sono appropriate per l’analita in questione? La Figura 34 mostra un insieme generico consigliato di condizioni di partenza note per la ritenzione e la separazione di un ampio intervallo di analiti. Come per qualsiasi modalità cromatografica, queste condizioni non sono appropriate in tutti i casi ed è possibile adottare strategie per migliorare la forma del picco e modificare la selettività e la ritenzione.

Per tali casi, le Figure 35, 36 e 37 mostrano gli approcci sistematici per migliorare la forma del picco, modificare la ritenzione e alterare la selettività; inoltre, non sono troppo diversi da quelli utilizzati nell’LC in fase inversa. La Figura 35 fornisce un protocollo per migliorare la forma del picco. Il punto di partenza iniziale è un insieme di condizioni consigliato sulla base del fatto che gli analiti di interesse siano principalmente di natura basica o acida. I composti acidi tendono ad avere una forma del picco migliore in condizioni acide, mentre i composti basici tendono a presentare una forma del picco migliore in condizioni basiche. Le strategie per migliorare la forma del picco includono la prova con un additivo diverso, la modifica della concentrazione dell’additivo e la modifica della fase stazionaria della colonna.

La Figura 36 fornisce un protocollo per incrementare la ritenzione. Come per qualsiasi forma di cromatografia liquida, la prima opzione consiste nell’utilizzare un co-solvente diverso (più debole). Il metanolo è il co-solvente più forte utilizzato nella CC; l’utilizzo di un co-solvente più debole, come l’acetonitrile o un altro alcol, incrementa il tempo di ritenzione sulla colonna. Possono essere efficaci anche l’appiattimento o la riduzione della pendenza del gradiente (riducendo la percentuale finale di co-solvente o incrementando la durata del gradiente). La miscelazione di co-solventi e la riduzione della concentrazione di metanolo indeboliscono la forza complessiva del co-solvente, incrementando così la ritenzione. La capacità di manipolare la densità della fase mobile nella colonna è una proprietà esclusiva dell’SFC e della CC. Questa operazione modifica la ritenzione complessiva, in quanto una densità minore corrisponde a una maggiore ritenzione. Questa operazione viene eseguita diminuendo l’impostazione dell’ABPR e/o incrementando la temperatura. Infine, un’altra strategia per incrementare la ritenzione consiste nell’utilizzo di una fase stazionaria diversa per la colonna.

La Figura 37 illustra un protocollo per modificare la selettività (ordine di eluizione, ritenzione relativa) della separazione. Un approccio consiste nel provare co-solventi diversi, come l’acetonitrile al posto del metanolo. Il passaggio da un co-solvente protico alcolico a un co-solvente aprotico non alcolico, per esempio l’acetonitrile, ha un effetto decisamente maggiore sulla selettività rispetto al passaggio dal metanolo a un altro alcol. Poiché una riduzione della concentrazione di metanolo indebolisce la forza complessiva del co-solvente, può incrementare la ritenzione e modificare la selettività. Anche la manipolazione della densità della fase mobile può modificare la ritenzione complessiva dell’analita, poiché questi effetti sulla densità possono variare per analiti specifici, il che può essere sufficiente per ottimizzare una determinata separazione. Infine, se necessario, questo protocollo consiglia una fase stazionaria diversa per la colonna.

Protocollo della Strategia di Sviluppo del Metodo per la Gamma di Colonne - Approccio 2

Il protocollo di sviluppo del metodo descritto nella sezione precedente è incentrato sulle condizioni di partenza generiche e sull’impatto della variazione delle proprietà della fase mobile per la regolazione di precisione di una separazione. In questa sezione vengono descritte altre due alternative, una per la separazione chirale e l’altra per la separazione achirale. Entrambe le alternative richiedono la combinazione di una colonna e di un metodo che, dal punto di vista statistico, raggiunga la percentuale di successo più elevata per un ampio gruppo di composti di test diversi. In generale, durante la selezione della colonna CC viene applicata la “forza bruta”, ma i protocolli suggeriti in questa sezione propongono una strategia passo-passo.

Strategia di Sviluppo del Metodo per Separazioni Chirali con Colonne UPC² Trefoil

Il protocollo di screening consigliato per i composti chirali si basa su tre fasi stazionarie chirali Waters UPC² Trefoil: AMY1, CEL1 e CEL2. Il protocollo di screening illustrato nella Figura 38 consiglia l’utilizzo di questo screening di quattro passaggi e quattro colonne con percorso ottimale e di miscele di co-solventi ottimizzate per massimizzare le probabilità di successo.

Secondo il protocollo, lo screening deve iniziare con AMY1, utilizzando una miscela di etanolo:isopropanolo:acetonitrile (1:1:1) con 20 mM di acetato di ammonio. Se il metodo non raggiunge la separazione desiderata, il metodo successivo deve utilizzare una colonna CEL1 con una miscela di metanolo e isopropanolo (1:1) con TFA allo 0,2% e così via. Le condizioni dettagliate del metodo sono fornite nel riquadro della Figura 38.

Strategia di Sviluppo del Metodo per Separazioni Achirali con Colonne UPC² Torus

Il protocollo di screening per una separazione achirale segue un approccio simile. Può essere ottenuta in massimo tre step, come descritto di seguito.

Passaggio 1

Iniziare con un rapido passaggio di esplorazione utilizzando una colonna Torus 2-PIC (3,0 x 100 mm) e le seguenti condizioni cromatografiche: 1,2 mL/min, MeOH 4-50% in 3 minuti, 30 °C, BPR a 2000 psi

Sulla base dei risultati ottenuti, annotare se:

1. a) Sono soddisfatti i requisiti di selettività e forma del picco, quindi ottimizzare ulteriormente il metodo solo se necessario
2. b) È stata ottenuta una buona selettività, ma è necessario migliorare la forma del picco, quindi analizzare una colonna Torus 2-PIC con un additivo, acido formico per gli acidi o un additivo basico per le basi.
3. c) Se i dati mostrano la necessità di una selettività diversa, passare al passaggio 2.

Passaggio 2

In base alla natura del campione, scegliere il percorso appropriato delineato nel ciclo idraulico di screening definito. Proseguire quindi lungo il circuito idraulico utilizzando la combinazione consigliata di colonna e co-solvente fino a ottenere una separazione adeguata.

Passaggio 3

Per eseguire la regolazione di precisione della separazione, è possibile ottimizzare la separazione regolando la composizione del co-solvente, la temperatura, l’additivo e la pressione del metodo. Le figure presenti nella sezione 4.7 mostrano come ottimizzare un metodo in questo modo.