Guida alla Cromatografia Convergente per Principianti

Come indicato nel capitolo precedente, la CC è molto simile all’LC dal punto di vista delle separazioni. Anche da un punto di vista strumentale, la CC è simile a un sistema LC (vedere la Figura 7) sotto tutti gli aspetti, fatta eccezione per un componente aggiuntivo, l’ABPR, che pressurizza l’intero sistema al di sopra di un valore impostato. Per sfruttare i vantaggi della fase mobile a base di CO₂ e conferirle i moderni benefici dell’UPLC, Waters ha modificato il sistema ACQUITY UPLC a bassa dispersione e tollerante alla pressione facendo in modo che i suoi componenti chiave fossero compatibili con un solvente comprimibile come la CO_2. In particolare, si trattava della pompa della CO₂ liquefatta per misurare il flusso attraverso il sistema CC. Anche se la CO₂ viene prima liquefatta (per esempio a 13 °C) è quasi tre volte più comprimibile del metanolo o dell’acetonitrile. Pertanto, la pompa doveva essere modificata per ottenere una cromatografia convergente riproducibile.

Problematiche dei sistemi analitici SFC del passato

Storicamente, i sistemi analitici SFC erano notoriamente inaffidabili. Erano tutti sistemi LC riadattati. Pompe, iniettori e rivelatori progettati per l’LC non erano pensati per funzionare con la CO₂ compressa.

Le pompe LC alternative a stadio singolo non erano in grado di comprimere ed erogare la CO₂ in modo accurato, ripetuto e affidabile. Non sono progettate per funzionare con un liquido comprimibile come la CO₂, causando composizioni di massa e velocità di flusso in massa variabili della fase mobile. In questo modo si modifica il potere di solvatazione della fase mobile e spesso si traduce in un cambiamento dei tempi di ritenzione da un’iniezione all’altra o da un sistema all’altro.

Anche le fasi mobili a base di CO₂ ad alta comprimibilità compromettono la sensibilità analitica a causa del rumore generato dalla pompa e dal regolatore di contro-pressione. Inoltre, a causa di notevoli problemi di scarsa accuratezza e precisione nell’utilizzo di iniezioni a loop parziale, gli strumenti HPLC riadattati spesso si limitano a iniezioni a loop pieno, limitando la scelta del volume di iniezione. A livello di sistema, i sistemi HPLC riadattati presentano un volume di dispersione notevolmente maggiore che provoca un allargamento di banda indesiderato, impedendo l’uso di colonne più efficienti con particelle da 1,7 mm. Questi inconvenienti limitano notevolmente la produttività potenziale e le prestazioni ottenibili con un sistema LC riadattato basato su CO₂.

Successivamente, esamineremo le innovazioni apportate a ogni singolo modulo del sistema ACQUITY UPC² (Figura 7).

Tecnologia di Gestione dei Solventi (Pompa)

Per garantire il controllo accurato e preciso delle velocità di flusso e della composizione della fase mobile, è necessario esaminare l’intero circuito idraulico del sistema. Come accennato in precedenza, le pompe HPLC riadattate, progettate per comprimere e fornire contemporaneamente il volume specificato di solvente in maniera accurata, non sono in grado di gestire un liquido comprimibile come la CO₂ liquida. Su alcuni strumenti SFC, la CO₂ in ingresso attraversa un dispositivo di pre-compressione e raffreddamento. Tale dispositivo si trova accanto al sistema cromatografico (Figura 8). Più questo dispositivo è lontano dalla pompa, più difficile diventa controllare la velocità di flusso in massa della CO₂ in maniera accurata, in quanto la densità della CO₂ può variare tra il passaggio di pre-compressione e quello di pompaggio, a seconda della temperatura ambiente. Inoltre, gli algoritmi di pompaggio (software di controllo interno) dei sistemi SFC tradizionali, generalmente progettati per erogare liquidi relativamente incomprimibili, fanno fatica a mantenere l’accuratezza della composizione, la precisione e la riproducibilità dei tempi di ritenzione. Gli stessi problemi si verificano quando si cerca di erogare basse percentuali di co-solvente (inferiori al 5%) in modo affidabile, rendendo difficile l’analisi di miscele con polarità diverse.

Al contrario, il sistema binario di gestione degli eluenti (BSM) Waters ACQUITY UPC² è progettato specificamente per la gestione di liquidi comprimibili con un dispositivo di pre-compressione completamente integrato per un controllo eccezionale della velocità di flusso in massa e della composizione di massa con conseguente affidabilità e riproducibilità dei tempi di ritenzione, così come un rumore di fondo trascurabile. Come indicato in precedenza, in un sistema con liquido comprimibile la densità del solvente controlla il potere di solvatazione della fase mobile, quindi un controllo preciso rappresenta un fattore critico per la riproducibilità. Gli algoritmi di controllo separati, fondamentali per componenti liquidi comprimibili e non comprimibili, miscelano accuratamente diverse composizioni di fase mobile, incluse basse percentuali di co-solvente (Figura 9) e forniscono profili di gradiente riproducibili (Figura 10).

I sistemi analitici SFC non hanno mai raggiunto livelli di controllo così precisi, in particolare per le separazioni in gradiente. Il sistema ACQUITY UPC² è progettato per controllare con precisione l’aspirazione, la compressione e l’erogazione della pompa, garantendo la riproducibilità attesa da un sistema UltraPerformance LC. Il controllo della densità volumetrica utilizzato nel sistema ACQUITY UPC² BSM supera il controllo del flusso in massa offrendo un’eccezionale precisione cromatografica. Di conseguenza si possono controllare i tempi di eluizione e ottenere un controllo eccezionale sull’intensità di solvatazione. Le teste della pompa sono raffreddate in modo indipendente, migliorando il controllo della densità della CO₂ e, di conseguenza, un’erogazione accurata della massa. La pompa e gli algoritmi di compressione integrati sono così efficaci e il controllo così preciso che è possibile utilizzare CO₂ liquida o gassosa come fase mobile iniziale. La Figura 11 mostra il funzionamento interno del BSM. La pompa del co-solvente è di tipo UPLC, mentre la pompa della CO₂ si trova dietro il coperchio nero isolato. Poiché il dispositivo di compressione e raffreddamento è integrato nella pompa, questo coperchio isolato consente un controllo più preciso della densità della CO₂ in ingresso.

Iniezione del Campione

I tradizionali sistemi analitici SFC, indipendentemente dal fatto che utilizzino iniettori a loop pieno o parziale, fanno fatica a iniettare bassi volumi di campione in modo riproducibile. Nella maggior parte dei casi sono possibili solo iniezioni a loop pieno; con iniezioni a loop parziale è difficile mantenere l’omogeneità del solvente iniettabile. Quindi l’accuratezza, la precisione e la linearità ne risentono, impedendo la quantificazione degli analiti. Grandi quantità di campione potrebbero andare sprecate a ogni iniezione, quindi molto spesso è necessario sostituire manualmente un loop del campione, limitando la flessibilità del sistema.

Il sistema di gestione degli eluenti ACQUITY UPC² è caratterizzato da un nuovo design a doppia valvola di iniezione (Figura 12). In questo modo il loop del campione primario viene sfiatato nello scarico, consentendo al campione di entrare nel loop a pressione atmosferica mantenendo l’omogeneità della fase mobile. Inoltre, la valvola di iniezione ausiliaria è stata progettata per ridurre gli impulsi di pressione dalla sequenza di iniezione e mitigare il carryover, consentendo iniezioni a loop parziale ripetibili e riproducibili (Figura 13). È possibile eseguire iniezioni da 0,1 a 50 μL con incrementi di 0,1 μL e, con le opzioni di lavaggio a due aghi, il carryover del campione è trascurabile. La Figura 14 mostra la linearità dell’iniezione a loop parziale da 1 a 10 mL con incrementi di 1 mL.

Rivelazione Ottica

Talvolta la rivelazione ottica è problematica con i sistemi analitici SFC. Le celle di flusso del rivelatore progettate per i sistemi HPLC potrebbero generare un volume di dispersione e un rumore di fondo inaccettabili. I rivelatori a indice di rifrazione, se utilizzati per l’SFC, provocano una curvatura e un rumore di fondo significativi con un liquido comprimibile, amplificando il rumore prodotto dal sistema di pompaggio. Solventi quali il metanolo e l’acqua, che sono comunemente usati nell’RPLC, hanno valori di RI molto simili (Figura 15), quindi gli effetti dell’RI nei metodi in fase inversa in genere non sono così significativi. La CO₂ ha un valore molto diverso dal metanolo (il co-solvente utilizzato più comunemente), il che rende l’intervallo degli indici di rifrazione delle sostanze più ampio rispetto a quello dell’LC, incrementando il rumore di fondo e limitando la sensibilità. Come ulteriore sfida, la densità, e quindi l’indice di rifrazione, di una fase mobile basata su CO₂ cambia nel corso di un’analisi del gradiente.

Il rivelatore PDA ACQUITY UPC² è progettato specificamente per liquidi comprimibili. Anziché lenti in zaffiro, che riducono la trasmissione di energia a lunghezze d’onda UV inferiori, le lenti del rivelatore PDA ACQUITY UPC² sono realizzate in silice ad alta resistenza, che resiste alla contro-pressione generata durante una separazione. Ciò contribuisce a massimizzare la sensibilità, a ridurre il rumore di fondo e a compensare le differenze negli effetti RI tra la CO₂ e il co-solvente organico. Il controllo termico del banco ottico migliora ulteriormente la stabilità della linea di base e mitiga gli effetti RI. Una cella di flusso in acciaio inossidabile a bassa dispersione consente di ottenere picchi di ampiezza ridotta, mentre il percorso di 10 mm massimizza la sensibilità e allo stesso tempo mantiene prestazioni spettrali ottimali. L’eccezionale livello di sensibilità ottenibile consente la quantificazione delle impurezze a livello di tracce (Figura 16).

Rivelazione con Spettrometro di Massa (MS)

Analogamente ai requisiti strumentali unici per l’adattamento della rivelazione ottica per la fase mobile comprimibile della CC, l’interfacciamento tra la CC e l’MS richiede delle modifiche per adattarsi alla comprimibilità della fase mobile. L’interfaccia CC-MS deve consentire la decompressione della fase mobile dallo stato pressurizzato alla pressione atmosferica all’interno della sorgente ionica degli spettrometri di massa odierni. Senza un’attenta considerazione della comprimibilità della fase mobile, il trasporto dell’analita nella sorgente ionica può essere influenzato negativamente. Uno scarso trasporto degli analiti può comportare una scarsa forma del picco e/o una ionizzazione insufficiente. Nella peggiore delle ipotesi, non si verificherà nessuna ionizzazione e l’analita di interesse non verrà rivelato dallo spettrometro di massa.

La decompressione della fase mobile compressa deve essere controllata indipendentemente dalla velocità di flusso della fase mobile, dalla composizione della fase mobile e dalla pressione del sistema post-colonna stabilite dal regolatore di contro-pressione automatizzato (ABPR). Inoltre, la decompressione deve essere gestita senza compromettere il trasporto efficiente dell’analita nella sorgente ionica. Per raggiungere questi obiettivi, l’interfaccia per la spettrometria di massa ACQUITY UPC² è stata progettata per una fase mobile comprimibile e utilizza un’interfaccia a flusso separato con un liquido di reintegro. L’interfaccia per la spettrometria di massa introduce una velocità di flusso costante della fase mobile, in genere compresa tra 300 e 500 µL/min (compressa), attraverso il limitatore separato verso lo spettrometro di massa. La parte rimanente della fase mobile viene inviata all’ABPR per il controllo della pressione del sistema post-colonna su un ampio intervallo di velocità di flusso e composizioni della fase mobile. La Figura 17 mostra una rappresentazione schematica dell’interfaccia della spettrometria di massa ACQUITY UPC², in cui viene evidenziata l’interfaccia separata e l’aggiunta del liquido di reintegro.

Il liquido di reintegro nell’interfaccia CC-MS ha un ruolo polivalente. È necessario principalmente per il funzionamento della ionizzazione per elettronebulizzazione (ESI) con un modificatore di circa il 5%. Poiché l’ESI è una tecnica di ionizzazione in fase liquida, per la ionizzazione è necessaria una certa quantità di liquido. Pertanto, quando la percentuale del modificatore della fase mobile è molto bassa, la quantità di liquido presente nella fase mobile è insufficiente per l’ESI. Quindi, l’aggiunta di liquido sotto forma di flusso di reintegro è necessaria per l’ESI a basse percentuali di modificatori. In secondo luogo, il liquido di reintegro può agevolare il trasporto degli analiti. A un certo punto del limitatore separato, la CO₂ passerà dallo stato denso ad alta pressione allo stato gassoso, andando a perdere il suo potere di solvatazione. Di conseguenza, dopo che la CO₂ è passata allo stato gassoso, è disponibile solo il modificatore liquido per dissolvere gli analiti e trasportarli nella sorgente ionica. Quando nella separazione si impiegano percentuali di modificatore pari a zero o molto basse, non è disponibile nessun liquido per trasportare gli analiti attraverso il limitatore separato nella sorgente ionica per la ionizzazione. In tali condizioni viene aggiunto del liquido di reintegro a monte del limitatore separato per agevolare il trasporto degli analiti nella sorgente ionica. La Figura 18 mostra un esempio di profili di picco che indicano un trasporto buono o scarso degli analiti. In questo caso, la velocità di flusso del liquido di reintegro è stata selezionata in considerazione del trasporto scarso (18A) e buono (18B) degli analiti.

Il liquido di reintegro è importante anche per il trasporto di analiti con una solubilità limitata nel modificatore liquido della fase mobile. A volte l’analita è altamente solubile nella miscela di modificatore liquido e anidride carbonica compressa, ma è meno solubile nel solo modificatore liquido. In questi casi, l’analita può precipitare dalla soluzione dopo la transizione della CO₂ allo stato gassoso nel limitatore separato, anche in presenza di alte percentuali di modificatore liquido. Quando la solubilità dell’analita nel modificatore liquido è insufficiente, la forma del picco è scarsa, il tubo di interfaccia è ostruito e/o la riproducibilità dei picchi è scarsa. L’aggiunta di un fluido di reintegro adeguato può aiutare a evitare tali difficoltà incrementando la solubilità dell’analita nella miscela appena formata di modificatore liquido e liquido di reintegro. Per esempio, analiti altamente lipofili possono essere altamente solubili in una fase mobile di CO₂/metanolo e relativamente insolubili nel metanolo da solo. In questo caso, è possibile aggiungere un liquido di reintegro non polare per ridurre la polarità netta della miscela di liquido modificatore e liquido di reintegro. L’analita lipofilo sarà più solubile nella miscela liquida a bassa polarità e sarà quindi trasportato più facilmente nella sorgente ionica.

Se necessario, i liquidi di reintegro nell’interfaccia CC-MS introducono nello spettrometro di massa anche composti che migliorano la ionizzazione. Questi composti possono essere aggiunti dopo la colonna, senza influire sulla separazione. I composti che migliorano la ionizzazione, come il 5% (in volume) di acqua e/o 20 mM di idrossido di ammonio, acido formico o acetato di ammonio, spesso sono in grado di incrementare l’efficienza di ionizzazione dell’ESI. La concentrazione e il tipo di composto che migliora la ionizzazione dipendono molto dall’analita e devono essere regolati in base a ciascuna applicazione per ottenere una risposta ottimale.

Una volta selezionata la composizione del liquido di reintegro, può essere regolata anche la velocità di flusso del liquido di reintegro per ottenere una risposta ottimale. È possibile esaminare un intervallo di velocità di flusso rispetto alla risposta MS. Una velocità di flusso troppo bassa può comportare uno scarso trasporto, mentre una velocità di flusso di reintegro troppo alta spesso porta a una riduzione del segnale MS. Assieme alla composizione del liquido di reintegro, la velocità di flusso ottimale del liquido di reintegro dipende dall’analita e dal metodo e, se si desidera ottenere la risposta massima del segnale, devono essere ottimizzate per ogni nuova applicazione. Inoltre, la composizione del liquido di reintegro e la velocità di flusso devono essere ottimizzate nuovamente quando si passa da una tecnica di ionizzazione all’altra, per esempio quando si passa dall’ESI alla ionizzazione chimica a pressione atmosferica (APCI).

In sintesi, l’interfaccia della spettrometria di massa ACQUITY UPC² è stata progettata specificamente per una fase mobile comprimibile e per l’interfacciamento con un moderno spettrometro di massa che impiega tecniche di ionizzazione chimica a pressione atmosferica come ESI, APCI, ESCi multimodale, fotoionizzazione a pressione atmosferica (APPI) e UniSpray.

Regolazione della Contro-Pressione

Una delle parti più critiche di qualsiasi sistema, la gestione di solventi comprimibili, è la capacità di controllare e mantenere la pressione all’interno del sistema in maniera accurata. Come abbiamo visto, un controllo impreciso della contro-pressione può incidere notevolmente sulla densità della fase mobile e, di conseguenza, sui tempi di solvatazione e ritenzione degli analiti. I sistemi SFC tradizionali sono spesso soggetti a un controllo impreciso e non accurato della contro-pressione a causa di molteplici fattori quali: scarso monitoraggio della pressione sul regolatore di contro-pressione (ABPR), loop di feedback a risposta lenta, motori passo-passo a bassa risoluzione, scarso controllo della pressione e del flusso nella pompa, così come il deterioramento dei componenti ABPR nel tempo.

Il sistema ACQUITY UPC² presenta un migliore controllo della contro-pressione grazie a un innovativo BPR statico e attivo a doppia espansione (Figura 19). Grazie a questa combinazione di controllo attivo e statico della contro-pressione, il BPR statico mantiene il sistema a una pressione minima, mentre il BPR attivo migliora il controllo del valore impostato dall’utilizzatore (Figura 20). Nel tentativo di migliorare ulteriormente la robustezza, il BPR a cartuccia statica viene riscaldato per mitigare il congelamento della fase mobile che può verificarsi in caso di decompressione rapida all’uscita dell’ABPR. Il BPR a doppia espansione è situato nel sistema di gestione della convergenza (CM) del sistema ACQUITY UPC² (Figura 21). Questo modulo alloggia anche il filtro anti-particolato in linea per la CO₂ in ingresso, il rivelatore di perdite di CO₂, la valvola di sfiato, la valvola limitatrice di pressione e la valvola di iniezione ausiliaria.

Prestazioni Complessive del Sistema

Infine, il sistema ACQUITY UPC² ha una dispersione intrinseca bassa, come i sistemi ACQUITY UPLC, che consente l’uso di colonne con diametro interno inferiore e particelle di dimensioni inferiori (Figura 22). Le colonne con diametro interno stretto incrementano la sensibilità, conservano il solvente e utilizzano velocità di flusso più adatte alla spettrometria di massa. Colonne con particelle di dimensioni inferiori incrementano l’efficienza di separazione e migliorano la risoluzione.