利用waters_connect^TM平台中的INTACT Mass应用程序简化ADC DAR和药物分布分析

waters_connect平台中的INTACT Mass应用程序集数据采集、处理、审查和报告功能于一体，可自动完成生物治疗药物LC-MS数据的质量数去卷积。在本应用简报中，我们使用INTACT Mass应用程序1.9版分析了抗体偶联药物(ADC)的药物/抗体比率(DAR)。本应用简报使用经FDA批准的赖氨酸偶联和半胱氨酸偶联ADC样品演示这些DAR分析工具。

优势

• 沃特世改进了INTACT Mass应用程序1.9版，新增DAR和药物分布自动计算功能，有助于简化单克隆抗体(mAb)偶联物的分析
• 得益于符合法规要求的waters_connect信息学平台，此ADC分析工作流程可应用于产品表征到产品放行检测的各个环节

waters_connect平台是一款基于应用程序的合规软件，提供多种基于应用程序的生物制药分析工作流程。而INTACT Mass应用程序是其中一款可以快速自动完成质量数去卷积、质量数确认及相关纯度评估的工具。它已经在多个领域展示出应用潜力，包括但不限于完整蛋白质¹、寡核苷酸^2-3、和合成肽⁴。自推出该应用程序以来，沃特世在这数年间不断增加新功能，包括自定义去卷积设置和峰积分事件等。INTACT Mass应用程序最新增加的功能是ADC分析，随着这类药物作为癌症和血液疾病的治疗药物重新引起关注，业内对该功能的需求也不断增长。过去，用户只能使用UNIFI™应用程序工作流程计算DAR和药物分布，而且必须使用一组自定义计算才能得出DAR值。INTACT Mass应用程序在处理功能方面的改进显著简化了这些计算，使得计算出错的可能性更低，同时确保这些分析仍然可以在合规平台上执行。

评估成功偶联到蛋白质上的药物载荷分子的变异性，是ADC和其他蛋白质偶联物的关键质量属性之一。这种变异性具体反映在药物分布（每种偶联物的相对百分比）和DAR值（根据每种偶联物的加权平均值得出的单个值）上。新发布的INTACT Mass应用程序1.9版可以代替用户自动执行这些计算。创建处理方法时，软件会用名为“Drug”（药物）的特殊标签来标示药物/载荷修饰。在处理质谱数据的过程中，软件会根据用户为非偶联蛋白质和药物修饰设定的预期质量数，自动匹配观测质量数与偶联物质的理论质量数。然后，使用带“Drug”（药物）标签的匹配组分（结合任何非偶联蛋白质）的相对MS响应，计算出DAR和药物分布。

分析ENHERTU™ (fam-trastuzumab-deruxtecan-nxki)（一种半胱氨酸偶联ADC）

ENHERTU (fam-trastuzumab-deruxtecan-nxki)是一种半胱氨酸偶联ADC，DAR为7-8，用于治疗多种乳腺癌、胃癌和胃食管癌⁵。由于半胱氨酸偶联ADC可能缺少连接重链和轻链的链间二硫键，使用LC-MS分析半胱氨酸偶联ADC时，为了保留ADC的完整结构，必须采用非变性分离条件和较为温和的离子源条件。因此，我们在BioAccord™系统上采用非变性体积排阻色谱-质谱法(SEC-MS)（详细信息参见之前发布的应用纪要⁶）分析ENHERTU (fam-trastuzumab-deruxtecan-nxki)。

非变性SEC-MS分析得到的去卷积质谱图（图1A）表明，大部分物质都可以匹配到偶联八个Deruxtecan药物载荷分子（标记为“D8”）的曲妥珠单抗N-糖型。所有物质中，只有一小部分被归属为偶联六个药物载荷分子的曲妥珠单抗（“D6”），如INTACT Mass应用程序的Results（结果）选项卡所示（图1B）。这张结果表列出了检测到的所有物质，以及它们各自的预期质量数和实测质量数、质量误差(ppm)，还有根据MS响应计算出的相对百分比。新的INTACT Mass应用程序1.9版Calculation Results（计算结果）选项卡（图1C）显示了软件计算出的DAR值和总体药物分布。与预期一致，ENHERTU (fam-trastuzumab-deruxtecan-nxki)的DAR值为7.97，与UNIFI应用程序分析出的结果和过往文献报告的值相当^5,7。根据相对MS响应可知，样品中98.7%都是偶联八个药物载荷分子的抗体。

分析KADCYLA™ (ado-trastuzumab-emtansine)（一种赖氨酸偶联ADC）

KADCYLA (ado-trastuzumab-emtansine)是一种经过充分研究的赖氨酸偶联ADC，预期DAR约为3.5，主要用于治疗乳腺癌^5-8。赖氨酸偶联ADC在偶联时利用的是溶剂暴露的赖氨酸残基，因此产生的偶联物混合物呈现出相当大的异质性。过往的KADCYLA (ado-trastuzumab-emtansine)研究曾检测到偶联0到8个药物载荷分子的偶联物，其中大部分偶联3或4个药物载荷分子。由于赖氨酸偶联过程不会破坏mAb的链间二硫键，因此分析KADCYLA (ado-trastuzumab-emtansine)时采用变性或非变性LC-MS条件均可。在变性反相液相色谱-质谱(RPLC-MS)条件下进行分析时，由于样品电荷态更高、间隔更近，谨慎的做法是使用PNGase F酶对KADCYLA (ado-trastuzumab-emtansine)进行去糖基化处理，降低MS谱图的整体复杂程度⁸。

在BioAccord系统上采用RPLC-MS法分析去糖基化ADC样品，然后在INTACT Mass应用程序中处理数据后得到的去卷积质谱图如图2A所示，图中的表格列出了偶联0到8个药物载荷分子的每种偶联物（D0-D8）的相对百分比。INTACT Mass应用程序计算出的总体DAR值为3.56，与之前使用UNIFI应用程序执行分析时报告的DAR值3.5一致^5-8。

本研究还采用非变性SEC-MS条件成功分析了KADCYLA (ado-trastuzumab-emtansine)，无需进行糖基释放。为便于比较，我们还在BioAccord系统上采用非变性SEC-MS条件（详细信息参见之前发布的应用纪要⁶）分析了相同的样品，然后使用INTACT Mass应用程序处理数据。非变性分析得到的去卷积质谱图（图2B）更加复杂，包含所有N-糖型。INTACT Mass应用程序对原始谱图数据进行去卷积处理、匹配糖基化物质和偶联物，并整理各DAR值下不同的偶联物形式，从而计算出平均DAR值和药物分布。图2B中的表格列出了D0到D8每种物质的相对丰度百分比计算值，以及平均DAR计算值(3.50)，这与公开文献^5-8报告的值以及过往研究中UNIFI软件计算出的值一致。因此，在ADC分析中，用户可以灵活选用符合实验目标的分离方法，并有望获得与其他方法相当的DAR和药物分布结果。

waters_connect平台中的INTACT Mass应用程序1.9版新增若干功能，提高了该工具自动分析偶联分子LC-MS数据的能力，从早期表征研究到产品放行检测中的验证分析，多场景适用。该软件集成的DAR和药物分布自动计算功能简化了ADC分析，为用户提供高效、自动化的工作流程，无论分析人员LC-MS经验深浅，皆可轻松上手。

1. Shion H, Boyce P, Berger SJ, Yu YQ. INTACT Mass- a Versatile waters_connect Application for Rapid Mass Confirmation and Purity Assessment of Biotherapeutics. Waters Application Note 720007547. February 2022.
2. Doneanu CE, Boyce P, Shion H, Fredette J, Berger SJ, Gastall H, Yu YQ. LC-MS Analysis of siRNA, Single Guide RNA and Impurities Using the BioAccord System with ACQUITY Premier and New Automated INTACT Mass Application. Waters Application Note 720007546. April 2022.
3. D’Esposito RJ, Doneanu CE, Gastall H, Berger SJ, Yu YQ. RNA CQA Analysis using the BioAccord LC-MS System and INTACT Mass waters_connect Application. Waters Application Note 720008130. November 2023.
4. Ranbaduge N, Shion H, Yu YQ. Streamlined LC-MS Analysis of Stress Induced Impurities of a Synthetic Peptide using the BioAccord System and the waters_connect INTACT Mass Application. Waters Application Note 720007752. October 2022.
5. Riccardi F, Bo MD, Macor P, Toffoli G. A comprehensive overview on antibody-drug conjugates: from the conceptualization to cancer therapy. Front. Pharmacol. 14. 2023.
6. Shion H, Yu YQ, Chen W. Analysis of Antibody Drug Conjugates (ADCs) by Native Mass Spectrometry on the BioAccord System. Waters Application Note 720006570. May 2019.
7. Martín M, Pandiaella A, Vargas-Castrillón E, Díaz-Rodriguez E, Iglesias-Hernangómez T, Cano CM, Fernández-Cuesta I, Winkow E, Perelló MF. Trastuzumab deruxtecan in breast cancer. Critical Reviews in Oncology/Hematology. 2024; 198: 104355. (http://doi.org/10.1015/j.critrevonc.2025.104355)
8. Chen L, Wang L, Shion H, Yu C, Yu YQ, Zhu L, Li M, Chen W, Gao K. In-depth structural characterization of Kadcyla (ado-trastuzumab emtansine) and its biosimilar candidate. MAbs. 2016; 8(7): 1210–1223.

UNIFI、BioAccord和waters_connect是沃特世科技公司的商标。ENHERTU (fam-trastuzumab-deruxtecan-nxki)是Daiichi-Sankyo Company, Limited的商标。KADCYLA (ado-trastuzumab-emtansine)是Genentech, Inc.的商标。