• 应用纪要

多反射飞行时间MS：一项用于深入表征mAb亚基的创新技术

多反射飞行时间MS：一项用于深入表征mAb亚基的创新技术
  • Jonathan Fox
  • Ying Qing Yu
  • Scott J. Berger
  • Nick Pittman
  • Waters Corporation
下载PDF 下载PDF

Application Brief

This is an Application Brief and does not contain a detailed Experimental section.

摘要

本技术简报展示了将ACQUITY™ Premier UPLC系统与Xevo™多反射飞行时间(MRT)质谱仪联用，分析来自NIST参比mAb标准品的mAb亚基的方法。使用waters_connect™软件平台中的Waters INTACT Mass™应用程序处理数据，全面了解每个亚基的产物异构体。分析结果表明，Xevo MRT MS平台具有高灵敏度、高质量分辨率和一致的亚ppm质量精度，并且可以使用waters_connect信息学平台中的INTACT Mass应用程序实现一体化数据采集、处理和审查。

优势

  • 高水平的灵敏度和动态范围，加上能够生成低至亚ppm范围质量精度的亚基数据，可深入表征mAb亚基并检测细微差异和修饰
  • 出色的数据重现性有利于统计比较，从而可靠地解析产品和工艺变化，并评估产品的可比性
  • 基于合规应用程序的一体化工作流程能够简化亚基数据的采集、处理和审查，使组织内更多人员能够成功进行亚基的LC-MS分析，并且只需简单培训即可熟练操作
  • 高效的数据分析工作流程结合了自动峰检测、去卷积、质量数确认和纯度分析计算功能，可减少数据审查时间，降低数据转录和手动计算错误风险，提高分析通量

简介

基于亚基的单克隆抗体分析已成为表征和监测产品变异备受青睐的分析工具。与肽图分析相比，亚基在LC-MS分析前的样品前处理更为简便，且由于将150 kD的mAb分解为约25 kD的亚基单元，与完整mAb分析相比能够揭示更低水平的产品变异。

Xevo MRT质谱仪系统采用创新的检测器几何结构与仪器设计，为mAb亚基分析提供出色的灵敏度、动态范围、质量分辨率及质量精度。该Q-Tof系统采用创新的多反射飞行时间技术显著延长离子飞行路径，质量分辨率高达100K且不受扫描速率影响，在宽m/z采集区域内保持一致。双增益ADC检测系统在提升灵敏度和扩展动态范围的同时，为生物分子分析提供了亚ppm至低ppm级的质量精度。高分辨率、高灵敏度与高质量精度的结合，有助于详尽的蛋白质表征分析，这对理解生物制药的结构与功能至关重要。Xevo MRT质谱仪系统可检测并表征复杂且低丰度的蛋白质异构体，例如因N端加工差异、糖基化及氧化产生的异构体，这些异构体可能显著影响生物制药的有效性、稳定性和安全性。

本研究通过waters_connect INTACT Mass应用程序处理数据，使研究人员能够确认产物身份并解析单个mAb亚基的变异特征。通过在早期表征研究阶段提供生物制药分子组成的详细信息，Xevo MRT质谱仪系统确保了最终产品的一致性和稳定性；同时，该方法在后期开发阶段的持续应用，进一步保障了生物治疗产品在商业化进程中的质量与一致性1,2。

ACQUITY Premier UPLC和Xevo MRT质谱仪系统
图1.ACQUITY Premier UPLC和Xevo MRT质谱仪系统。一款采用多反射器的质谱仪，专为生物制剂和生物制药的高性能分析而设计。

实验

样品

沃特世mAb (NIST mAb)亚基标准品，25 µg/样品瓶（沃特世P/N：186008927），通过添加100 µL Milli-Q水制得浓度为250 ng/µL的溶液。

使用waters_connect INTACT Mass应用程序采集并处理沃特世mAb亚基标准品10次重复进样(250 ng)的数据。采用自动化色谱峰选择和谱图去卷积功能简化质量数确认、杂质表征和纯度评估工作。

亚基物质的理论质量数如下所示。

理论质量数表

理论质量数表

方法条件

液相色谱条件

液相色谱系统：

ACQUITY Premier UPLC系统（二元系统）

检测：

UV 280 nm

样品瓶：

TruView LCMS认证12×32 mm螺纹口全回收样品瓶，配有瓶盖和预切割PTFE/硅胶隔垫（P/N：186005663CV）

色谱柱：

ACQUITY Premier BEH C4蛋白分析专用柱, 300 Å, 1.7 µm 2.1 mm x 50 mm（P/N：186010326）

柱温：

60.0 °C

样品温度：

6.0 °C

进样体积：

1 µL

流速：

0.400 mL/min

流动相A：

0.1%甲酸的水溶液

流动相B：

0.1%甲酸的乙腈溶液

梯度表

梯度表

质谱条件

质谱系统：

Xevo MRT质谱仪

模式：

MS

质量范围：

400~4000 m/z

极性：

正离子

扫描速率：

1 Hz

锥孔电压：

40 V

锥孔气流速：

0 L/h

离子源温度：

120 °C

脱溶剂气温度：

500 °C

脱溶剂气流速：

800 L/h

毛细管电压：

3.00 kV

结果与讨论

在单克隆抗体(mAb)分析中，mAb亚基分析相较于肽图分析具有多项优势。其工作流程更快、更简单，样品前处理步骤更少，能够确保分析样品的一致性，并能够在结构域水平同时表征多个属性，因此成为表征抗体和产品质量监测的重要工具。本研究使用ACQUITY Premier UPLC与Xevo MRT质谱仪的联用系统采集了来自NIST mAb参比标准品的沃特世亚基标准品的数据，旨在评估整体工作流程性能并报告特定的仪器功能（质量精度、质量分辨率和灵敏度）。图2~图5展示了IdeS酶解亚基的色谱分离结果（图2）、原始数据（图3和4）和处理后的数据（图5），反映了系统性能及此常规mAb表征方法的性能指标。

RP LC-MS分离色谱图
图2.还原型IdeS NIST mAb亚基的RP LC-MS分离色谱图，用于详细分析和分配每个分离亚基上的产品变异。
每个IdeS酶解NIST mAb亚基的汇总原始m/z谱图
图3.每个IdeS酶解NIST mAb亚基的汇总原始m/z谱图，图中展示了电荷态包络，每个峰代表一个连续的电荷态。mAb HC上的糖型分布在scFc片段上，可通过各电荷态直观呈现。
高分辨率MS数据
图4.高分辨率MS数据，可观察到每个25 kDa亚基电荷态的同位素分离谱图（以26+和12+电荷态为例）。虽然原始数据中25 kDa亚基的单一同位素峰难以直接观测，但电荷去卷积算法可通过识别各电荷态同位素峰的系统间距，计算得到亚基的表观观测同位素质量或平均质量。
每个mAb IdeS的BayesSpray去卷积质谱图
图5.使用waters_connect INTACT Mass应用程序中的“自动去卷积”设置生成的每个mAb IdeS酶解亚基的BayesSpray去卷积质谱图。所有亚基物质（包括糖基化的Fc/2片段）的去卷积平均质量误差均小于±2 ppm（多数为亚ppm级别）。

waters_connect INTACT Mass应用程序可用于自动完成各类生物分子的质量数确认和纯度评估流程。

使用BayesSpray去卷积算法处理INTACT Mass应用程序自动生成的IdeS酶解NIST mAb亚基LC-MS分析结果，处理后的数据（图6）在INTACT Mass应用程序的数据审查窗口中显示。搭载Xevo MRT质谱仪的分析系统可区分紧密相邻的糖型峰，同时其灵敏度的提升使低丰度糖变体的检测成为可能，且所有糖变体的质量数误差保持一致。

INTACT Mass去卷积IdeS酶解
图6.NIST mAb IdeS亚基样品单次分析的INTACT Mass去卷积IdeS酶解亚基结果

图7展示了十次重复亚基进样的TIC响应色谱图，所有重复样的重叠图显示出一致的UPLC色谱分离和一致的LC-MS检测响应。这种一致性不仅对单个样品的可靠评估至关重要，还为设定分析性能目标及支持多批次或生产工艺的对比研究提供了依据。

在针对25 kDa Fd'亚基去卷积质谱数据的分析中，这种一致性也很明显，本次分析采用优化的去卷积参数（优化元素组成）来进一步提高亚基质量数的测量精度。结果表明，平均质量数误差约为220 ppb，均方根(RMS)误差为320 ppb（图8）。这些发现凸显出在上述简单分析条件下，质谱测量对这种蛋白质亚基的高精度和重现性。

最后，酶解Fc亚基中两种低丰度糖型的去卷积质谱响应数据（图9）同样表明，十次重复进样中相对糖型定量的一致性良好。

NIST mAb IdeS酶解亚基十次重复LC-MS分析的TIC重叠图
图7.NIST mAb IdeS酶解亚基十次重复LC-MS分析的TIC重叠图，显示了一致的LC保留和MS检测器响应。
测量25 kD Fd'亚基去卷积质量数
图8.使用优化的去卷积设置（指定元素组成）通过IdeS酶解NIST参比mAb样品10次重复进样测量25 kD Fd'亚基去卷积质量数，产生的平均质量数误差约为220 ppb（RMS误差为320 ppb），相对丰度约为77%，十次重复分析的去卷积组分强度标准差为1%。
两种Fc较低丰度糖型的相对丰度百分比
图9.10次重复进样中两种Fc较低丰度糖型的相对丰度百分比

结论

亚基分析可为单克隆抗体的产品变异提供重要见解，适用于初始表征及支持产品和工艺开发的持续分析。Xevo MRT质谱仪在亚基分析中的性能优势包括：能够在宽m/z范围内保持一致性能（分辨率、质量精度），适用于亚基变体的不同电荷态，并且MS响应覆盖多个数量级。该系统的高灵敏度和亚ppm级至低ppm级质量精度能够可靠分配低丰度修饰，同时通过测量一致性支持方法性能的统计验证，助力多批次质量与工艺开发QbD研究。

这种出色的MS检测性能辅以waters_connect INTACT Mass应用程序内简化的自动化合规工作流程，支持一体化数据采集、处理、审查和报告，可从单个样品采集亚基数据，并涵盖更大样品组的汇总分析。

总体而言，对于mAb亚基分析，Xevo MRT质谱仪系统是一种稳定高效的平台，可帮助生物制药分析人员在生物治疗药物的开发和商业化方面做出自信的决策，避免了使用电子表格和其他第三方软件工具进行手动数据处理/报告时可能出现的复杂问题。

如需了解更多信息，敬请访问https://www.waters.com/nextgen/global/products/mass-spectrometry/mass-spectrometry-systems/xevo-mrt.html

参考资料

  1. Xevo MRT | 多反射飞行时间质谱仪 | Waters.
  2. Lisa Reid, Matthew E. Daly, Lee A. Gethings, Jayne Kirk. Metabolomics Workflow using a Xevo™ MRT Mass Spectrometer. Waters Application Note, 720008552, October 2024.
  3. https://www.waters.com/nextgen/global/applications/biopharma-and-pharma/protein-therapies/intact-and-subunit-protein-analysis-solutions.html.
  4. Henry Shion, Patrick Boyce, Scott J. Berger, Ying Qing Yu.INTACT Mass™ - 一款用于生物治疗药物快速质量数确认和纯度评估的通用waters_connect™应用程序. 沃特世应用纪要, 720007547ZH, 2022年2月.

特色产品

720008755ZH，2025年3月

返回顶部 返回顶部