利用Xevo™ MRT多反射超高分辨质谱进行高通量代谢组学分析

本实验基于Xevo MRT MS成功开发出6 min短梯度高采集速率的方法，凭借该系统超高的质谱分辨率与快速采集能力，相较传统10-20 min的代谢组学采集方法，在保证检测质量不受影响的同时，显著提升了检测效率，为大队列样本的高通量代谢组学研究提供了解决方案。

样品前处理

• 血清样品取样50 μL，加入200 μL预冷的乙腈 ，振荡10 min；12,000 rpm，4度下离心10 min ；取上清液100 μL ，用于LC-MS分析。
• 组织样品及粪便样品取样30 mg，放入钢珠研磨30 s，加入300 μL预冷的80% 乙腈，振荡10 min；12,000 rpm，4度下离心10 min ；取上清液100 μL，用于LC-MS分析。

• Waters Xevo™ MRT MS采用多反射超高 分辨率飞行时间（MRT）技术可在较宽的m/z范围内提供始终如一的质谱分辨率和优异的质量精度，即使采集速率高达100 Hz，Xevo MRT质谱仪也能实现高达100,000 FWHM的质量分辨能力与<500 ppb的质量精度。
• ACQUITY Premier™系统与 Premier 色谱柱 采用一体设计，其目的在改善了金属敏感分析物（如磷酸化代谢物）的分离和检测，能够大幅降低未检出分析物带来的风险，从而提高效率以及结果可信度。
• waters_connect™是专为保障数据可靠性 和安全性而构建的信息学平台，功能灵活， 支持扩展，助力用户快速取得科研和业务成果；其 DATA Convert 功能可在数据采集过程中同步生成.mzML 通用格式文件，该格式兼容 MS DIAL、MZmine 等第三方软件，实现数据的跨平台应用支持。
• MARS组学软件（Mass Analytica）涵盖了 基于LC-MS 的非靶向和半靶向代谢组学所需的所有步骤：包括数据转换和处理，峰检测，统计分析，自动化MS和MS/MS-based 代谢物注释，定量和生物通路分析等。

数据处理软件

使用waters_connect™ 软件进行数据采集，在waters_connect 的MS Toolkit 应用程序中将数据进行可视化，并通过MARS组学软件（Mass Analytica）进行数据处理，使用人类代谢组数据库(HMDB)进行化合物鉴定。

实验结果谱图展示

1. 样品BPI叠加图展示：图2为小鼠粪便样本重复6针进样对应的BPI图，其色谱分离度良好，且谱图重叠性高，表明该方法具有良好的重现性，适用于大队列组学研究。

2. 特定离子色谱图和质谱图展示：本实验使用50 mm的短柱结合0.5 mL/ min较高的流速进行数据采集，色谱峰较窄，其中以利血平正离子m/z 609.2807@2.78 min为例，其色谱峰宽5 s左右，可以采集到10个点，见图3a; 提取实际样本中利血平连续6针的EIC图，其谱图叠加良好，RSD=2.37% ， 满足相对定量的要求，见图3b；为实现上述定量采点数的需求，采用较高的质谱采集速率(MS 20 Hz, MS/MS 50 Hz)进行数据采集，其中利血平对应的MS和MS/MS谱图见图3c，其母离子对应的分辨率在8万以上，显示出Xevo MRT MS超高的质谱分辨率且不受采集速率的影响。

3. 样品MS/MS谱图展示，见图4：Xevo MRT MS的高灵敏度和采集速度，可以提供足够多高质量的MS/MS 谱图，用于后续的鉴定；如下图所示，样品在约0.01 min的时间窗口内(2.766-2.775 min)可以采集到18张MS/MS谱图，单针6 min的检测时长，可以采集到接近10, 000张MS/MS谱图。

1. 峰提取结果查看，见图6：使用MARS组学软件进行数据处理，共提取到13710个化合物，其中6,565个化合物得到MS/MS，MS/MS覆盖率接近50%。

2. 数据过滤及化合物鉴定，见图6：可以选择对上述数据进行过滤（MS/MS过滤，空白过滤），使用HMDB 数据库进行搜库鉴定（包含217,753个化合物，50,412张MS/MS），最终有4,915个化合物可得到鉴定结果，其中质量偏差在2 ppm以内的化合物有3,623个；其中以离子m/z 203.0825@1.53 min为例，鉴定结果为色氨酸，它常被视为肠道菌群代谢活性的特征代谢物之一，其质量偏差为 300 ppb。

3. 分别使用三种不同的采集方法对小鼠的心、肝、脾、肺、肾、血清、粪便样本进行测试，具体采集参数见表1，可以看到三种方法对于各类型样本的代谢物检出数量均在1,000+以上（化合物均包含MS/MS, 质量偏差在2 ppm以内）；其中相比传统的12min_top10方法，使用6min_top20的方法整体获得了更优的检出数量，见图7，表明Xevo MRT具有相当高的灵敏度和扫描速度，适用于创建短梯度高采集速率的方法，用于高通量代谢组学的研究。

本实验采用ACQUITY Premier UPLC-Xevo MRT MS进行DDA模式采集，结合代谢组学软件对小鼠不同类型样本进行代谢组学分析：

• Xevo MRT MS采用多反射超高分辨率飞行时间（MRT）技术可在相当高的扫描速度下提供始终如一的 质谱分辨率：采用MS 20Hz, MS/MS 50Hz进行数据采集，小鼠粪便样本连续6针进样谱图叠加良好，其中以利血平正离子m/z609.2807@2.78 min为例，其一级和二级母离子对应的分辨率皆在8万以上，且6 针 RSD=2.37%，满足相对定量要求；
• Xevo MRT系统的高灵敏度、采集速度和质量精度，保证了MSMS覆盖率和化合物鉴定数量：使用DDA TOP20进行采集，单针6 min的检测时长，可以得到接近10,000张MS/MS谱图；使用Mars组学软件进行数据处理，小鼠粪便样本可以提取到13,710个化合物，其中6,565个化合物得到MS/MS，MS/MS覆盖率接近50%；使用HMDB数据库进行搜库，最终有3,623个化合物可得到鉴定结果；
• 使用三种不同的采集方法对小鼠不同类型样本进行测试，代谢物检出数量均在1,000+以上；其中使用 6min_DDA Top20的方法整体获得了更优的检出数量（代谢物均包含MS/MS谱图且母离子质量偏差＜2 ppm）表明Xevo MRT MS具有相当高的灵敏度和扫描速度，适用于创建短梯度高采集速率的方法，用于大队列样本的高通量代谢组学研究。

1. MARS: A Multipurpose Software for Untargeted LC–MS-Based Metabolomics and Exposomics.”Analytical Chemistry 96.4(2024):1468–1477 
2. Goracci, Laura , et al. “Lipostar, a Comprehensive Platform-Neutral Cheminformatics Tool for Lipidomics.” Analytical Chemistry (2017):acs.analchem.7b01259. 
3. Gall, Le , et al. “Metabolomics of fecal extracts detects altered metabolic activity of gut microbiota in ulcerative colitis and irritable bowel syndrome.”.