基于Xevo™ MRT和全球天然产物社会分子网络系统（GNPS） 进行绿茶提取物成分分析

全球天然产物分子网络系统（Global Natural Products Social Molecular Networking，GNPS）是一个基于网络的质谱分析生态系统，它通过分子网络分析、谱图库搜索、高通量去重复等功能，助力天然产物和代谢组学研究。其中特征分子网络分析（Feature-Based Molecular Networking，FBMN）是其核心功能之一：它通过计算质谱图间相似性，将结构相似的有机物聚集成簇，形成 “分子家族”，这能直观呈现各成分关系，有助于发现结构类似物或新化合物。而 waters_connect平台自带的DATA Convert数据转换工具，在数据采集的同时可以直接将数据转换为.mzML通用格式，能够非常方便兼容第三方软件进行数据处理。我们以绿茶提取物为例，演示如何基于Xevo MRT MS和GNPS进行天然产物成分分析，图2为其工作流程图。

• Waters Xevo™ MRT MS采用多反射超高分 辨率飞行时间（MRT）技术可在较宽的m/z 范围内提供始终如一的质谱分辨率，即使在100 Hz的扫描速率下分辨率结果也不会受到影响。
• Xevo MRT MS经过精心设计，将高端技术 融入台式平台中，可帮助用户解决棘手难题。创新的采集系统配备双增益模数转换器，在高动态范围内亦可保持长期的系统稳定性，从而确保始终如一的优异数据质量、耐用性和重现性。
• 在Xevo MRT质量分析器内(见图1)，4 m飞行 路径将发生总共8次反射，在高达100 Hz的扫描速率下，分辨率可达100,000 FWHM， 实现出色的MS/MS性能。

数据处理软件

使用waters_connect™ 进行数据采集，后续使用Progenesis QI或MS DIAL进行数据预处理后导出文件，上传预处理文件至GNPS¹网站进行特征分子网络分析。

实验流程

1. 数据预处理：在进行特征分子网络分析之前，首先需要借助代谢组学软件进行数据预处理（峰提取，峰对齐，样本分组，解卷积等），waters_connect平台自带的DATA Convert数据转换工具，在进行数据采集的同时可以直接将数据转换为.mzML通用格式，供Progenesis QI，MS DIAL2，Mzmine3， XCMS4 等组学软件对数据进行处理，这确保了在适应多样化工作流程时具备相当高的灵活性，同时通用格式也简化了跨团队的数据共享。 以沃特世官方组学软件 Progenesis QI为例，在使用其完成数据预处理后， 可以选择导出“Feature quantification table”和“MS2 MGF”两个文件，用于后续的FBMN分析，见图3。

此外，以第三方代谢组学软件MS DIAL为例，可以选择直接加载.mzML格式数据，数据导入并处理后可以得到5,559个特征离子的MS/MS谱图，见图4。

在MS DIAL菜单栏，选择“Export>Alignment result”，可导出“Feature quantification table”和”MS2 MGF”两个文件，用于后续的FBMN分析 ，见图5。

2. FBMN分析：登录GNPS网站，选择“Feature Networking”（注意和“Molecular Networking”有区别）， 进入FBMN界面，提交上述的两个文件；此外可以选择加载.msp格式的MS/MS数据库（程序会自动加载GNPS网站自带的数据库包），并适当调整峰提取参数后，提交并等待结果，见图6。

1. 绿茶提取物样品BPI图，见图7，其色谱分离度良好。

2. 样品鉴定结果。 GNPS网站搜库共得到203个化合物的鉴定结果，包含84种黄酮、22种酚酸、9种苯丙素、12种有机酸及其衍生物、12种核苷、5种香豆素、6种糖类、19种脂质，以及34种其他类型化合物，部分化合物鉴定结果如下表所示，质量偏差均小于1 ppm，显示出Xevo MRT优异的质量精度，见表1。

3. 天然产物结构类似物分析结果 通过FBMN分析，可以得到236个分子网络团簇，如表2所示。

如图8所示，以第一个分子网络为例，共有94个节点，其中离子m/z 441.0833 GNPS搜库结果为Epicatechin gallate（表儿茶素没食子酸酯），与其结构相似度较高的离子有m/z 417.0825、m/z 425.0886、m/z 431.0980、m/z 455.0992、m/z 457.0775，除m/z 457.0775被鉴定为Epigallocatechin Gallate之外，其余四个离子均未被GNPS搜库匹配到。

以离子m/z 425.0886为例，其与Epicatechin gallate的MS/MS谱图对比如图9所示，存在两个共有碎片离子125、169，对应没食子酸基团；另外，两者有多个碎片离子质荷比相差16（少一个羟基），表明该物质黄酮骨架上缺少一个羟基基团；最终推测其为Epiafzelechin-3-O-gallate。 m/z 425.0886、m/z 441.0833、m/z 457.0775三个化合物属于结构类似物，都含有没食子酸基团，主要区别在于黄酮骨架上酚羟基的数目不同。

再以m/z 459.0939为例，其与m/z 457.0775 Epigallocatechin Gallate的MS/MS谱图对比，如图10所示，同样存在两个共有碎片离子125、169，表明其存在没食子酸基团；另外存在一个质荷比相差2的离子（2H），推测其黄酮骨架发生了加氢开环反应，未见文献报道，可以对其结构进行合理推测。

4. 使用waters_connect平台进行结果验证

如图11所示，分别为m/z 425.08、m/z 441.08、m/z 457.07和m/z 459.0939对应的二级谱图及推测分子结构，并基于waters_connect平台对其二级碎片进行了结构注释，它们各自所有的高强度碎片离子均被注释，进一步表明了推测结果的合理性。

其中m/z 459.09为推测的分子结构，两个关键碎片离子169和307对应的碎片结构断裂合理，如图12所示，可能属于绿茶提取物中新发现的化合物，后续还需要进一步证明。

类似地可以进行其他结构类似物离子的MS/MS谱图比对和结构解析，其中m/z 417.0825推测为Kaempferol 3-O-α-L-arabinoside，m/z 431.0980推测为kaempferol 3-rhamnoside，m/z 455.0992推测为 Epicatechin 3-O-(3-O-methylgallate)。

使用Xevo MRT MS联合GNPS对绿茶提取物进行化学成分分析：

• 得益于Xevo MRT MS的高分辨率及高扫描速度，使用DDA TOP15进行数据采集，可以获得非常多高质 量的MS及MS/MS谱图，绿茶提取物样本在单一负模式下可以得到5,559个特征离子的MS/MS谱图；
• waters_connect平台自带的DATA Convert数据转换工具，在数据采集的同时可以直接将数据转换 为.mzML通用格式，能够非常方便地供Progenesis QI、MS DIAL等组学软件对数据进行处理，提高数据分析效率；
• GNPS利用Xevo MRT MS提供的高质量MS/MS谱图，可以快速鉴定到203个化合物，包含84种黄酮、22 种酚酸、9种苯丙素、12种有机酸及其衍生物、12种核苷、5种香豆素、6种糖类、19种脂质，以及34种其他类型化合物，该方法也可以应用于其他复杂天然产物样品的快速分析鉴定；
• 通过FBMN分析，可以得到236个分子网络团簇，其中以m/z 441.0833 epicatechin gallate为例，可以找 出6种结构类似物，其中有5种未被GNPS注释鉴定，通过MS/MS谱图比对和结构解析，分别被推测鉴定，并基于waters_connect平台对其分子结构进行注释验证，其中包含一种未被文献报道的物质，应该属于绿茶提取物中新发现的化合物 。

1. Louis-Félix Nothias, et al. “Feature-based molecular networking in the GNPS analysis environment.” Nature Methods (2020):1–4.
2. Tsugawa, Hiroshi , et al. “MS-DIAL: data-independent MS/MS deconvolution for comprehensive metabolome analysis.” Nature Methods 12.6(2015):523–526.
3. Heuckeroth, Steffen, et al. “Reproducible mass spectrometry data processing and compound annotation in MZmine 3.” Nature Protocols 19.9(2024).\
4. Forsberg, et al. “Data processing, multi-omic pathway mapping, and metabolite activity analysis using XCMS Online.” Nature Protocols Erecipes for Researchers (2018).