BioAccord^TM LC-MS系统针对非变性MS分析的功能改进

本应用简报阐述了BioAccord LC-MS系统近期的功能改进对于需要进行非变性质谱(MS)分析的生物制药分析工作流程而言的重要意义。BioAccord系统的ACQUITY™ RDa™检测器扩展了质谱检测窗口，现在正离子模式下的质量数上限可达m/z 9000，因此可以更有效地对分子更大的蛋白质复合物和蛋白质偶联物进行MS分析。这进一步提升了该系统的分析能力，使其更适合这类新兴生物药物的表征、属性监测和质量控制应用。

优势

• 正离子模式下的质量数检测上限高达m/z 9000，充分拓宽了采集质量数范围，因此可以分析单克隆抗体(mAb)聚集体、非共价蛋白质复合物等分子更大的蛋白质，还可以对药物/抗体比率(DAR)较高的抗体偶联药物进行非变性MS分析。
  

沃特世最初于2019年推出的BioAccord LC-MS系统（图1）是一款高分辨率紧凑型台式飞行时间质谱(TOF MS)系统，专为实现稳定的生物制药分析而设计。该系统适用于分析完整单克隆抗体和蛋白质^1-2、肽图^3-4、抗体偶联药物(ADC)⁵、游离寡糖^6-7、寡核苷酸^8-9，以及mRNA^10-11和病毒载体¹²等新兴生物治疗药物。它具备自动化仪器设置、基于工作流程运行分析以及waters_connect™合规信息学平台等关键功能，方便发现、开发、制造和QC/放行机构的分析人员迅速上手使用该系统，没有任何MS经验水平门槛。

BioAccord系统的离子源经过优化设计，电离更温和，在尤其需要保留蛋白质三级结构的非变性MS应用中可以大显身手。生物制药分析中应用越来越广泛的非变性MS分析包括非共价蛋白质复合物或偶联物的结构评估，以及与离子交换色谱(IEX)^13-14和体积排阻色谱(SEC)⁵等非变性色谱技术联用。

值得注意的是，变性和非变性MS分析的原始合并质谱图存在显著差异（图2）。例如，美国国家标准技术研究所(NIST) mAb参比物质8671在非变性条件下（图2B）的MS信号显示，较高m/z区间内的电荷态较少（对应于较低m/z区间内的电荷态），与典型的变性LC-MS模式（图2A）形成对比。这种差异表明折叠蛋白质的可带电荷表面积比变性蛋白质更少。旧款BioAccord系统支持的正离子m/z范围上限为7000，事实证明这足以满足大多数变性和非变性mAb分析的需求。不过，随着生物制药的研发不断突破创新界限，更复杂的分子和偶联物不断问世，沃特世改进了BioAccord系统，现在它的质量范围已扩展至m/z 9000，为分析分子更大或更复杂的蛋白质带来了更大的灵活性。

本研究进行了非变性SEC-MS分析，该分析使用ACQUITY UPLC™ BEH™ SEC, 200 Å, 1.7 µm, 2.1 × 150 mm蛋白分析专用柱（p/n: 186008471) ，柱温保持30 ℃，以50 mM醋酸铵(pH 6.8)为流动相运行10 min等度分离。ACQUITY RDa检测器设置为在电喷雾电离(ESI)正离子模式下收集MS数据，比较以下两个质量范围：1)高质量范围(HMR)：m/z 400-7000；2)新扩展的质量范围(EMR)：m/z 400-9000。两种模式下的校正都可以使用现有的标准BioAccord校正溶液完成，该溶液同样适用于较低m/z模式的系统校正。

本研究的目标蛋白质样品有两种，一种是酵母乙醇脱氢酶(ADH)，这是一种已知的多聚蛋白质，另一种是经过冻融处理的英夫利昔单抗样品，其中含有低比例SEC-MS可以检测的高分子量(HMW)物质。

yADH是一种天然会自缔合形成四聚体复合物的胞质蛋白¹⁵。使用标准HMR (m/z 400-7000)采集模式，ACQUITY RDa检测器轻松识别出了ADH四聚体（约148 kDa）和二聚体（约74 kDa）（图3A）。应用EMR (m/z 400-9000)模式时，额外观察到了八聚体¹⁶（约296 kDa）（图3B），这表明该模式可以分析分子较大的非共价蛋白质复合物和聚集体。

在另一组实验中，我们让英夫利昔单抗样品经历若干个冻融循环以诱导蛋白质聚集。UV280色谱图中检测到低比例的HMW物质（图4A，以红色突出显示）。我们在BioAccord系统上通过质谱检测也观察到了这种HMW物质（图4B插图，红色谱图），并将它与单体峰的谱图（图4A插图，黑色谱图）做了比较。观察到的HMW（二聚体）物质出现在ACQUITY RDa检测器EMR模式下拓宽的m/z 6500-8500范围内，且质量数与英夫利昔单抗二聚体的预期质量数一致（图4B下图）。这种二聚体在原来的HMR设置下无法检出。

BioAccord系统在正离子模式下的质谱检测窗口已扩展至m/z 9000，可以有效分析较高分子量的物质或者m/z因偶联或LC入口系统条件而变大的物质。本研究通过非变性SEC-MS分析成功检测到了ADH蛋白质的高级别多聚体，并且分离出一种mAb二聚体。BioAccord系统的EMR模式直接满足了日益增长的行业需求：表征分子更大的蛋白质复合物和载荷日益复杂的蛋白质偶联物（例如ADC或抗体-寡核苷酸偶联物），以及研究治疗药物的聚集倾向。

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BioAccord、RDa、waters_connect、ACQUITY和BEH是沃特世科技公司的商标。