使用20 mm大孔径HILIC色谱柱对糖蛋白进行快速LC-MS分析
摘要
本文展示了使用20 mm ACQUITY™ Premier BEH Amide, 300 Å, 1.7 µm糖蛋白分析专用柱在HILIC模式下进行快速糖蛋白分离和LC-MS分析的方法。
简介
由于单克隆抗体（mAb）等生物制药的迅速发展，整个开发过程都需要高通量的方法。亲水作用色谱(HILIC)因其能够分离高极性物质，因此可作为表征蛋白质糖基化修饰的有用工具。研究表明，大孔径酰胺键合固定相能够出色地分离完整蛋白质糖型1,2。 本篇技术简报展示了采用较短的2.1 × 20 mm ACQUITY Premier BEH™ Amide, 300 Å, 1.7 µm糖蛋白分析专用柱（P/N：186011017）可以为糖蛋白提供有效的LCMS质量数数据，并且相较于150 mm色谱柱，该短柱的分析速度提高了5倍以上。
结果与讨论
图1和2a展示了使用2.1 × 20 mm色谱柱和2.1 × 150 mm色谱柱，以相同的梯度斜率（相对于柱体积）和乙腈:水梯度(0.1% TFA)分离糖蛋白性能测试标准品（P/N：186008010）得到的UV和MS色谱图。该测试标准品含RNA酶A（无糖基化形式）和RNA酶B及其糖基化形式（Man5至Man9）。尽管在主要峰之间观察到分离度有所损失，但在20 mm色谱柱和150 mm色谱柱上获得的MS数据相当（图2b和2c）。在20 mm色谱柱和150 mm色谱柱获得的去卷积质量数也一致（表1）。重要的是，使用20 mm色谱柱的分析速度比使用150 mm色谱柱快了5倍以上。该方法的额外优势在于，流动相用量减少了7倍以上，样品体积减少了4倍。
图1.在2.1 × 20 mm ACQUITY Premier BEH Amide, 300 Å, 1.7 µm糖蛋白分析专用柱和2.1 × 150 mm ACQUITY Premier BEH Amide, 300Å, 1.7 µm糖蛋白分析专用柱上分离糖蛋白性能测试标准品（4 mg/mL，溶于0.1% TFA/80%乙腈溶液）获得的UV (214 nm)色谱图。流动相A：0.1% TFA水溶液，流动相B：0.1% TFA乙腈溶液。在2.67分钟内（20 mm色谱柱）或20分钟内（150 mm色谱柱），流动相B的比例从67%降至60%。流速：0.2 mL/min。进样体积：0.25 μL（20 mm色谱柱）或1 μL （150 mm色谱柱）。柱温：45 °C。尽管20 mm色谱柱存在分离度损失，但其分析速度比150 mm色谱柱快了五倍以上。
图2.在2.1 × 20 mm ACQUITY Premier BEH Amide, 300 Å, 1.7 µm糖蛋白分析专用柱和2.1 × 150 mm ACQUITY Premier BEH Amide, 300Å, 1.7 µm糖蛋白分析专用柱上对糖蛋白性能测试标准品(4 mg/mL)的LC-MS分析结果。LC条件与图1所用的条件相同。使用Xevo™ G2 XS QTof进行MS检测。a.分离获得的色谱图；b.使用20 mm色谱柱（上图）和150 mm色谱柱（下图）获得的糖蛋白峰的合并谱图；c.使用20 mm色谱柱（上图）和150 mm色谱柱（下图）获得的糖蛋白单电荷态峰。使用20 mm色谱柱和150 mm色谱柱获得的MS数据相当。
表1.使用20 mm色谱柱和150 mm色谱柱分离糖蛋白性能测试标准品获得的蛋白质鉴定、理论分子量和去卷积分子量结果。
结论
20 mm ACQUITY Premier BEH Amide, 300 Å, 1.7 µm HILIC糖蛋白分析专用柱可以有效分离RNA酶A和RNA酶B糖型。20 mm色谱柱的分析速度比150 mm色谱柱快5倍以上，并且乙腈的消耗量明显更少。尽管RNA酶糖型之间的分离度有所降低，但20 mm和150 mm色谱柱所得到的MS数据相当，确保了高通量方法中糖蛋白鉴定的高度可靠性。
参考资料
- Lauber M.A., McCall S.A., Alden B.A., Iraneta P.C., and Koza S.M. 采用大孔径酰胺键合固定相开发完整糖基化蛋白的高分离度HILIC方法.沃特世应用纪要.720005380ZH.2015年4月.
- ACQUITY UPLC BEH Amide 300Å, 1.7 m糖蛋白分析专用柱和糖蛋白性能测试标准品.沃特世维护和使用手册.720005408ZH.2021.
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