• 应用纪要

使用微波辅助萃取和5分钟快速等度HPLC方法定量分析麦角固醇

使用微波辅助萃取和5分钟快速等度HPLC方法定量分析麦角固醇
  • Adam Bengtson
  • Paul D. Rainville
  • Stephanie Harden
  • Waters Corporation
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摘要

近年来，功能性蘑菇产品以营养补充剂、饮料、食品和其他产品等出现在商店货架，风靡市场。所有蘑菇中都存在一种化合物麦角固醇，据称，它具有多重健康功效，例如经紫外线照射后可转化为维生素D2。麦角固醇的测定通常需要先进行皂化反应，然后进行萃取，步骤繁琐。本应用纪要采用快速简便的微波辅助萃取法，从而避免了皂化反应。麦角固醇定量分析所用的系统为配备ACQUITY™ 2998光电二极管阵列(PDA)检测器的Arc™ Premier系统，在XBridge™ Premier BEH™ C18色谱柱上进行5 min快速等度洗脱。使用本文中开发的方法分析包含功能性蘑菇的混合样品。Empower™软件的峰纯度工具证实麦角固醇峰无共洗脱现象。

优势

  • CEM Discovery 2.0微波合成仪可快速、轻松地进行样品前处理，避免皂化反应
  • 5 min快速等度方法降低了溶剂消耗，从整体来讲方法更加环保
  • Empower软件峰纯度工具确保所有峰在最终方法中实现良好分离

简介

功能性蘑菇是一种热门营养保健品，不同种类的蘑菇被宣称具有多种功效。然而由于不同菌种所含化合物繁多，加之保健品市场缺乏规范标准，给开发高质量分析方法带来了挑战。麦角固醇作为所有真菌中共有的化合物，已被研究证实具有缓解炎症疼痛、降低心血管疾病发病率、抗氧化、抗菌及抗肿瘤等健康功效1-5。 麦角固醇不仅可作为质量指标，经紫外线照射后还能转化为维生素D2补充剂6。 美国FDA已批准将其作为维生素D2补充剂应用于谷物等特定食品7。

目前蘑菇中麦角固醇的提取定量方法众多。多种样品前处理方法都已成功萃取出麦角固醇，包括索氏抽提、超声辅助萃取、微波辅助萃取和超临界流体萃取。多数方法需在萃取前进行皂化反应步骤，但像微波辅助萃取等方法无需经过这个冗长繁琐的步骤也能获得理想效果8。

本文所述研究提供了一种快速的等度方法，可用于各种功能性蘑菇中麦角固醇的分离和定量。使用经过优化的微波辅助萃取方法从蘑菇样品中萃取麦角固醇。利用ACQUITY 2998 PDA检测器对蘑菇样品中的麦角固醇进行鉴定和定量分析。使用3D PDA数据与Empower软件中的峰纯度工具相结合，评估麦角固醇的光谱均一性。实验建立了线性范围，用于测定功能性蘑菇萃取物中麦角固醇的浓度。

实验

样品前处理

使用CEM Discovery 2.0微波合成仪对微波消解法进行优化，然后进行萃取9。蘑菇粉购自当地的GNC保健品商店。干燥的蘑菇粉中包含有猴头菇、云芝、灵芝、冬虫夏草、灰树花和桦褐孔菌。称取40 mg样品，加入于Discovery 2.0（配备小型搅拌棒）的反应容器中，其中含有25 mL HPLC级变性乙醇。按照微波消解条件表中的参数设置微波方法。虽然方法中的最大压力设置为300 psi，但大多数萃取过程中的压力维持在100 psi左右。萃取液使用0.2 µm尼龙过滤膜过滤。然后采用氮气流干燥溶液。最终将干燥的琥珀色油状萃取物溶解于含10%二甲基亚砜(DMSO)的HPLC级变性乙醇中，配制成2 mg/mL的溶液。

样品描述

麦角固醇购自Sigma Aldrich（德国达姆施塔特）。用含10% DMSO的甲醇配制麦角固醇储备液，再稀释以制备浓度范围为0.001~0.1 mg/mL的标准溶液。

微波消解条件

仪器：

CEM Discover 2.0微波合成仪，CEM公司，美国北卡罗来纳州

温度：

132 °C

时间：

20 min

压力：

300 psi

功率：

300 W

搅拌：

中

液相色谱条件

液相色谱系统：

Arc Premier QSM-r

检测：

ACQUITY PDA 2998 @ 280 nm

样品瓶：

1 mL全回收样品瓶，P/N：186000385DV

色谱柱：

XBridge Premier BEH C18 2.5µm, 4.6 × 50 mm, P/N：186009847

柱温：

60 °C

进样体积：

10 µL

流速：

1 mL/min

流动相：

含0.1%甲酸的12:88水:乙腈溶液

数据管理

色谱软件：

Empower 3.8.0

结果与讨论

采用Arc Premier系统配合梯度洗脱法，对XBridge Premier BEH C18 (2.5µm × 4.6 × 50 mm)和XSelect Premier CSH™ C18 (2.5µm × 4.6 × 50 mm)两根色谱柱进行了筛选评估。结果表明，XBridge BEH C18色谱柱可提供更好的分离效果，因此被选定用于后续的方法开发。色谱柱筛选采用20 min内5%~99%流动相B的梯度程序。初始筛选条件已能实现良好分离，其分离度和峰拖尾情况均优于目标方法的预设标准。后续的方法优化主要针对分析时间、峰拖尾及峰高进行改进。

鉴于该分析物为单一组分且无相邻洗脱干扰物，我们尝试了等度洗脱模式。根据筛选运行的结果，最终测试了88%B、89%B和90%B三种等度条件。采用88%B等度洗脱条件时，麦角固醇具有足够长的保留时间，可有效避开色谱柱前沿引起的基线干扰。最终洗脱效果如图1所示。该方法的分离度大于2.5，峰拖尾因子为1.0。

蘑菇萃取样品中与其他成分分离的麦角固醇样品色谱图
图1.蘑菇萃取样品中与其他成分分离的麦角固醇样品色谱图。

在方法开发过程中，确保目标色谱峰不含共洗脱成分至关重要。通常情况下，可采用质谱法或PDA检测进行峰纯度测定。由于麦角固醇等固醇类化合物在电喷雾条件下不易电离，本研究采用PDA评估峰纯度。图2所示的峰纯度分析结果表明，峰纯度角小于Empower软件自动计算出的阈值，证明麦角固醇峰具有光谱均一性，表明麦角固醇不存在共洗脱分析物。

蘑菇萃取物中麦角固醇峰的峰纯度分析示意图
图2.蘑菇萃取物中麦角固醇峰的峰纯度分析示意图。

本研究绘制了标准曲线，用于测定蘑菇萃取物中麦角固醇的浓度。该方法的线性范围为0.001~0.1 mg/mL，该范围可覆盖文献报道数据（约为298~1245 mg/100 g干蘑菇，按本样品前处理方法折算约为0.006~0.024 mg/mL）10。 本研究中发现，每100 g干蘑菇粉萃取物中含有约305 mg麦角固醇。计算所用线性曲线见图3。

采用最终方法建立的麦角固醇标准曲线，浓度范围为0.001~0.1 mg/mL。R2为0.999，表明定量分析在此范围内呈良好线性关系
图3.采用最终方法建立的麦角固醇标准曲线，浓度范围为0.001~0.1 mg/mL。R2为0.999，表明定量分析在此范围内呈良好线性关系。

结论

本研究基于Arc Premier UHPLC系统（PDA检测）开发了蘑菇中麦角固醇分离和含量测定的快速方法。采用CEM Discovery 2.0微波合成仪实现了快速萃取，同时避免了冗长的皂化步骤。通过Empower软件的峰纯度工具结合所采集的3D PDA光谱数据，有效确保了麦角固醇的光谱纯度。该方法线性良好，在蘑菇经此萃取处理后的麦角固醇预期浓度范围内可实现准确定量。

参考资料

  1. S. Shao, M. Hernandez, j. Kramer, D. Rinker, R. Tsoa.Ergosterol Profiles, Fatty Acid Composition, and Antioxidant Activities of Button Mushrooms as Affected by Tissue Part and Developmental Stage.J. Agric.Food Chem. 2010, 58: 11616–11625.
  2. K. Yasukawa, T. Aoki, M. Takido, T. Ikekawa, H. Saito, T. Matsukawa.Inhibitory Effects of Ergosterol Isolated from the Edible Mushroom Hypsizius marmoreus on TPA-induced Inflammatory Ear Oedema and Tumor Promotion in Mice.Phytother.Res. 1994, 62: 10-13.
  3.  J. Yang, L. Mills, G. Nair.Cyclooxygenase inhibitory and antioxidant compounds from the mycelia of the edible mushroom Grifola frondosa. J. Agric.Food Chem. 2002, 50: 3479-3482.
  4. L. Fan, H. Pan, T. Soccol, A. Pandey, R. Soccol.Advances in mushroom research in the last decade.Food Technol.Biotech. 2006, 44: 303-311.
  5. T. Ravi Subbiah, W. Abplanalp, Ergosterol (Major Sterol of Baker’s and Brewer’s Yeast Extract) Inhibits the Growth of Human Breast Cancer Cells in Vitro and the Potential Role of its Oxidation Products.Int.J. Vitam Nutr.Res. 2003, 73: 19-23.
  6. J. Barreira, M. Oliveira, I. Ferreira.Development of a Novel Methodology for the Analysis of Ergosterol in Mushrooms.Food Ana.Met. 2014, 7(1): DOI:10.1007/s12161-013–9621-9.
  7. FDA.Food Additives Permitted for Direct Addition to Food for Human Consumption (Vitamin D2 Mushroom Powder) 21 C.F.R S172.382. U.S. Food and Drug Administration.2020.
  8. K. Papoutsis, S. Grasso, A. Menon, N. Brunton, J. Lyng, J. Jacquier, D. Bhuyan.Recovery of Ergosterol and Vitamin D2 from Mushroom Waste – Potential Valorization by Food and Pharmaceutical Industries.Trend in Food Science & Technology.2020, 99: 351–366.
  9. S. Heleno, M.A. Prieto, L. Barros, A. Rodrigues, M. Barreiro, I. Ferreira.Optimization of Microwave Assisted Extraction of Ergosterol from Agaricus bisporus L.By-products Using Response Surface Methodology.Food and Bioproducts Processing.2016, 100: 25-35.
  10. K. Phillips, D. Ruggio, R. Horst, B. Minor, R. Simon, M. Feeney, W. Byrdwell, D. Haytowitz.Vitamin D and Sterol Composition of 10 Types of Mushrooms from Retail Suppliers in the United States.J. Agric.Food Chem.2001,59: 7841–7853.

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