在HRMS系统上定量分析使用OligoWorks™ SPE微孔板试剂盒从大鼠血浆中提取的脂质偶联反义寡核苷酸(ASO)

发现生物分析实验室在药物发现过程中发挥着关键作用。这些实验室的每个项目都要在短时间内筛选大量的潜在候选药物，筛选工作必须勤勉并高效，才能确保快速制定决策。因此，这些实验室依赖于标准化的分析工作流程，助力实现稳定的样品前处理和LC-MS定量分析，从而大幅缩短方法开发时间。本研究介绍了使用OligoWorks SPE微孔板试剂盒从大鼠血浆中提取脂质偶联ASO的高回收率，以及采用通用HRMS数据采集方法在不影响数据质量的前提下尽可能提高分析生产率。

优势

• OligoWorks SPE微孔板试剂盒是一种不含洗涤剂的标准化试剂盒解决方案，用于从生物基质中提取治疗性寡核苷酸进行LC-MS定量分析，所需的方法开发工作非常少
• Xevo™ G3 QToF HRMS仪器的灵敏度高、耐用性好，能够准确地检测并定量分析低浓度的寡核苷酸治疗药物；有利于发现和早期开发实验室高效筛选候选药物
• 工作流程简单精简，各类发现生物分析实验室都可以采用和实施

寡核苷酸治疗药物(ONT)能够在基因转录和翻译水平上有效解决疾病生物学问题，同时具有高靶向特异性和低毒性，是当今许多药物开发商的重点关注领域。随着这类核酸治疗药物的产品线不断扩展，业界也愈加需要灵敏、准确且耐用的生物分析方法，以支持这类核酸治疗药物在各开发阶段的发现和推进。发现生物分析实验室由于需要筛选大量的潜在候选药物，因此力求简化分析测试的各个环节以提高工作效率。适用于各种寡核苷酸的标准化样品前处理方法在这方面非常有用，可以为这些实验室节省大量的方法开发时间和成本。此外，通常使用高分辨率质谱(HRMS)以非靶向方式收集数据，从而能够对多种分析物部署一种单一、通用的方法。HRMS系统不仅可以获得信息丰富的数据，这些数据后期还可以重新分析，以便更好地了解分析物ADME谱图并筛选目标代谢物，从而加快候选药物的研究进展。

本文介绍了使用OligoWorks SPE微孔板试剂盒（以下简称OligoWorks试剂盒）从大鼠血浆中提取脂质偶联反义寡核苷酸(ASO)，然后在LC-HRMS系统上进行定量分析的工作流程。OligoWorks试剂盒是一种简单且适用性广的样品前处理解决方案，能够使生物基质中的多种治疗性寡核苷酸获得高回收率且基质效应低。提取到的样品随后使用ACQUITY™ H-Class UPLC™与Xevo G3四极杆飞行时间(QToF) HRMS仪器配合通用数据采集方法进行LC-MS分析，这种方法有利于对分析物实现高灵敏度、稳定且高效的定量分析，证明标准化分析工作流程可以提高发现生物分析实验室执行治疗性寡核苷酸分析的分析生产率。

LC-MS色谱分离和实验条件

化学品、试剂、材料和溶剂

脂质偶联ASO LC-MS标准品（单同位素中性质量数6046.08484 Da）购自Waters™ Corporation（美国马萨诸塞州米尔福德）（P/N：186010747）。内标(IS)为定制合成的脂质偶联寡核苷酸（单同位素中性质量数5716.9361 Da，与目标分析物的区别在于几个碱基对），由Biosearch Tech（丹麦吕斯楚普）制造。

MS级丙酮、甲醇、水、乙腈、异丙醇、六氟异丙醇(HFIP)、N,N-二异丙基乙胺(DIPEA)和乙酸铵均购自Sigma Aldrich（美国密苏里州圣路易斯）。K2 EDTA大鼠血浆购自BioIVT（美国纽约州韦斯特伯里）。不含DNA/RNA酶的蒸馏水购自ThermoFisher Scientific（P/N：10977015），用于寡核苷酸标准品的前处理和SPE样品洗脱液的稀释。OligoWorks试剂盒（P/N：186010614）购自沃特世公司（美国马萨诸塞州米尔福德）。

制备OligoWorks SPE清洗试剂

OligoWorks SPE清洗液1：称取3.84 g乙酸铵，加水定容至1 L，然后将pH调节至5.5，制得50 mM乙酸铵缓冲液(pH 5.5)。

OligoWorks SPE清洗液2：评估2种不同的清洗溶液作为潜在的清洗液2。

• 将100 mL甲醇加入900 mL水中，制备10%甲醇/90%水溶液
• 将300 mL甲醇加入700 mL水中，制备30%甲醇/70%水溶液

储备液、标准曲线和QC样品前处理

将脂质偶联ASO和IS复溶于50 μL 20%丙酮:80%不含DNA/RNA酶的水中，各制得浓度为100 nmol/mL的储备液。将脂质偶联ASO加标至大鼠血浆中，创建标准曲线(1~1,000 pmol/mL)和QC数据点（LQC-5 pmol/mL、MQC-50 pmol/mL和HQC-750 pmol/mL）。使用20%丙酮溶液将内标进一步稀释100倍，使其浓度为1 nmol/mL。然后将IS储备液加入标准曲线和QC点中，最终浓度为50 pmol/mL。

使用OligoWorks SPE微孔板试剂盒进行样品预处理和萃取

制备的标准曲线样品和QC样品一式三份，按照《OligoWorks SPE试剂盒和组件维护和使用手册》(720008066EN)中提供的方案从大鼠血浆中萃取。简而言之，就是将100 μL标准曲线样品和QC样品加入Eppendorf 1 mL深孔板中，使用RapiZyme蛋白酶K酶解模块中提供的试剂和方案进行酶解，随后使用OligoWorks SPE微孔板和洗脱液进行萃取。

脂质偶联ASO LC-MS标准品（P/N：186010747）为gapmer化学修饰的16残基反义寡核苷酸(ASO)，包含完全硫代磷酸化的骨架、5'端棕榈酸酯修饰和甲氧基乙基修饰末端，序列如下文所示。此寡核苷酸的阴性对照序列与哺乳动物基因没有任何同源性，5'端修饰采用5'-棕榈酸酯-C6 CE亚磷酰胺来实现。该修饰的化学结构如下所示。星号(*)表示PS键，MOE表示2'甲氧基乙基修饰，MeC表示5-甲基胞苷残基。

5’ d 5-Pal-*-MOE-MeC-*-MOE-G-*-MOE-MeC-*C*G*A*T*A*A*G*G*T*A*- MOE-MeC-*-MOE-A-*-MOE-MeC 3’

内标也为脂质修饰的反义寡核苷酸，具有与目标分析物类似的修饰，仅几个残基不同，如下所示：

5' d 5-Pal-MOE-MeC-*-MOE-G-*-MOE-MeC-*C*G*A*T*A*A*G*G*T*-MOE-A-*-MOE-MeC-*-MOE-A 3'

OligoWorks SPE方案优化

按照《OligoWorks SPE维护和使用手册》中描述的样品前处理和萃取方案进行脂质偶联ASO的初始血浆回收率和基质效应实验。使用ACQUITY PREMIER LC系统和Xevo TQ-Absolute串联四极杆(TQ)仪器进行LC-MS分析，使用[M-9H⁺]^-母离子671.1 m/z和碎片离子95.1 m/z进行MRM分析，色谱条件和色谱柱与“方法”部分所述相同。使用初始方案时，脂质偶联ASO和IS的回收率分别约为80%和60%。基质效应<15%（数据未显示）。尽管这些回收率值都在可接受范围内，但我们仍尝试进一步优化SPE方案以提高回收率并尽可能提高灵敏度。

OligoWorks SPE WAX吸附剂是一种聚合物反相弱阴离子交换混合模式吸附剂，这种双模式功能可用于优化上样、清洗和洗脱步骤中的方案。我们首先优化清洗液2的步骤，因为该步骤会影响目标分析物的保留，同时也会影响不良基质组分的去除。将清洗液2中的有机相组成由30%甲醇（维护和使用手册中推荐的清洗液2的组成）减少至10%，明显提高了目标脂质偶联ASO的回收率，但导致内标的回收率降低。在这个特定的例子中，甲醇组成增加导致目标脂质偶联ASO在清洗液2步骤中部分洗脱。相反，当清洗液2中的甲醇组成减少时，内标的回收率降低。其性能展示请参见图1。从该数据可以明显看出，即使是序列密切相关的分析物，其回收率仍有可能因为SPE清洗液2步骤中的有机溶剂百分比而表现出差异。

LC-MS方法开发

LC梯度优化

以《OligoWorks SPE维护和使用手册》中提供的LC梯度作为脂质偶联ASO和IS分析的起点。使用该梯度，分析物和IS洗脱时已趋近色谱运行结束（数据未显示），这可能是因为偶联脂质赋予了分析物额外的疏水性。因此需要优化LC梯度，增加起始条件中有机溶剂的百分比，并使用更陡峭的梯度：流动相B在3.25分钟内从25%增加到75%。使用这些LC条件后，分析物和内标峰在梯度中间洗脱（数据未显示）。此外，ACQUITY™ Premier BEH™ C₁₈寡核苷酸分析专用柱大幅减少了寡核苷酸与色谱柱硬件之间的非特异性阴离子相互作用（基线峰宽≈5 s），有助于实现更高的灵敏度和重现性，这些色谱柱使用寡核苷酸进行了QC测试，可确保理想性能。

HRMS数据采集和处理

从详细表征到准确定量，Xevo G3 QToF MS会尽可能地收集目标分析物的样品信息。使用waters_connect中的UNIFI应用程序创建MS全扫描实验（m/z 50~2000，扫描时间0.2 s），以非靶向方式收集数据。此方案可对多种分析物采用单一的采集方法，而无需额外的方法开发。图2显示了从大鼠血浆中提取的100 pmol/mL脂质偶联ASO标准品的母离子[M-9H⁺]^-（m/z 671.2297，图2A）和母离子[M-7H⁺]（m/z 863.2976，图2B）的MS谱图。

Xevo G3 QToF不仅易于采集数据，它的高分辨率还有助于我们对数据进行更深入的研究，并且能够使用窄质量数提取(XIC)窗口来大幅提高信噪比(S/N)。TQ仪器常规运行的单位分辨率为+/-0.7 Da。HRMS系统的高分辨率可以稳定地区分m/z相差0.001 Da的质量数。处理HRMS数据时，可以通过评估不同的XIC窗口消除不良基质组分的MS信号，同时重点关注目标分析物的m/z，确保信号足够强。用户可在保持分析物信号不变的前提下尽可能减小背景噪音，从而提高信噪比。但是，在达到某一点之后，XIC窗口收紧开始对分析物峰面积计数产生不利影响，但对色谱图中的背景峰没有显著影响。因此，找到理想的XIC窗口就是要在“尽可能减小干扰背景组分的信号”和“不影响分析物峰面积计数”之间取得平衡。

对于脂质偶联ASO，评估的XIC窗口为0.7~0.01 Da。从图3可以明显看出，随着XIC窗口变窄，基质组分中的非特异性背景峰持续变小，色谱背景更干净，分析选择性也更高。在最终的定量分析中，我们选择0.025 Da的XIC窗口，因为它在干净的背景与足够的分析物峰面积计数之间获得了理想平衡。

灵敏、准确且精密

使用OligoWorks试剂盒提取大鼠血浆中添加的脂质偶联ASO，然后在Xevo G3 QToF MS系统上进行分析，线性浓度范围为1~1,000 pmol/mL，线性拟合结果(r²)为0.991，使用1/x加权。标准曲线上所有数据点的准确度范围为87.8~114.2%，CV范围为1.29~10.61%（表1）。

LQC (5 pmol/mL)、MQC (50 pmol/mL)和HQC (750 pmol/mL)的平均准确度%和平均%CV分别为98.19%和3.78%、113.18%和0.85%，以及106.24%和3.85%（表1）。标准曲线和QC点的峰面积计数随浓度的增加而线性增加，如图4中的代表性QC色谱图所示。

发现生物分析实验室往往在寻找标准化、精简的工作流程，以便为数量众多的项目和分析物提供支持。为提升工作效率和分析生产率，我们介绍了一种简单、易于执行的工作流程：使用OligoWorks SPE微孔板试剂盒从生物基质中提取目标分析物，然后在Xevo G3 QToF HRMS仪器上对分析物进行非靶向定量分析。

脂质偶联ASO LC-MS标准品能够在1~1000 pmol/mL范围内建立线性标准曲线，所有标准曲线和QC点均通过了FDA生物分析方法验证指南的要求。