HPLC自动进样器性能II：利用Alliance™ iS HPLC System提高USP方法的进样精度
摘要
高效液相色谱(HPLC)系统的自动进样器性能可能受方法条件和仪器特性的影响。低进样体积、高有机相的样品稀释剂等苛刻方法条件需要高精度才能满足严格的适应性要求。样品抽吸机制和进样器吸取速度等仪器特性通常因供应商而异，这些差异可能会影响自动进样器的精度性能。对于希望在不同供应商的HPLC系统上运行符合严格精度适应性标准的方法的分析实验室来说，这可能是一个挑战。本研究采用美国药典(USP)中的四种药典HPLC方法，在严格的精度标准和严苛的方法条件下，比较了Alliance iS HPLC System和类似HPLC系统的进样精度。通过评估峰面积的重现性，作为各系统自动进样器性能的衡量指标。
优势
- 在Alliance iS HPLC System上，针对多种样品稀释剂和进样体积均能保持高精度
- 在Alliance iS HPLC System上运行具有挑战性的USP方法，可满足严格的进样精度标准
- 与类似的HPLC系统相比，Alliance iS HPLC System在处理高有机相样品稀释剂时表现出更高的精度
简介
在美国药典(USP)的众多规定方法中，进样精度是常见的系统适应性标准。进样精度是用于评估高效液相色谱(HPLC)系统中自动进样器性能的指标。自动进样器负责将精确等分样品输送至HPLC系统流路1。 其性能可能受到方法条件和仪器特性的影响2,3,4。 为确保采集的数据准确并满足方法的适应性要求，自动进样器需要具备高性能。
由于系统设计的差异，不同供应商的仪器特性（如样品抽吸机制和进样器吸取速度等）会有所不同。样品抽吸通常由计量装置或采样注射器控制1。 而进样器吸取速度通常设为缺省值，且常因仪器供应商而异4。 这些特性差异增加了在不同供应商的系统上运行方法的复杂度。在某套HPLC系统上表现良好的常规方法，在另一套HPLC系统上可能无法满足系统适应性标准。因此，评估仪器特性对自动进样器性能的影响至关重要。
本研究选用四个USP分析各论，考察了不同仪器特性对Alliance iS HPLC System和同类HPLC系统进样精度的影响。所涉HPLC系统包括采样注射器和计量装置两种抽吸机制，并采用不同的进样器吸取速度。这些USP分析方法均具有严苛的方法条件：样品稀释剂中的有机相含量各不相同（20%~100%有机相）、低进样体积(6.6 µL~20 µL)，以及严格的进样精度标准(0.73%~2.0%)。
实验
带有星号(*)的方法参数表示根据第<621>章色谱法的要求，对原始各论方法进行了调整，以适配现代色谱柱和尺寸5,6。 氯沙坦钾和非诺贝特各论中指定使用4.0 × 250 mm的色谱柱，方法已放大为使用现代色谱柱（直径4.6 × 250 mm），并相应调整了流速和进样体积5,6。 酮康唑各论中指定使用3 µm粒径的色谱柱，方法已调整为使用3.5 µm粒径，并对流速和梯度区段进行了调整5,6。 所有调整均根据USP <621>规定，并使用沃特世方法转换计算器完成7。
根据USP <621>，要求RSD ≤ 2.0%的各论方法需要进行五次重复进样，RSD ≥ 2.0%的方法则需要进行六次重复进样5。 非诺贝特各论要求进行六次重复进样，RSD要求≤ 1.0%8。 为确保所有各论方法的一致性，实验过程中均采用六次重复进样。
USP各论中的氟康唑分析
样品描述
按照USP各论方法，将USP氟康唑RS（P/N：1271700）用20/80乙腈/水配制为浓度0.5 mg/mL的标准溶液。
方法条件
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液相色谱系统： |
Alliance iS HPLC System 系统X HPLC系统 系统Y HPLC系统 Alliance e2695系统 Arc™ HPLC系统 |
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分离模式： |
等度 |
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检测： |
所有系统均采用紫外检测（260 nm，10点/秒） |
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样品瓶： |
TruView™ pH控制LCMS认证透明玻璃23 × 32 mm螺纹口样品瓶，配有瓶盖和预开口PTFE/硅胶隔垫，2 mL体积，100个/包（P/N：186005666CV） |
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色谱柱： |
Atlantis™ dC18 4.6 × 150 mm, 3 µm（P/N：186001342） |
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柱温： |
40 °C |
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样品温度： |
15 °C |
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进样体积： |
20 µL |
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流速： |
0.5 mL/min |
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流动相： |
乙腈/水(20/80) |
USP各论中的氯沙坦钾分析
样品描述
将USP氯沙坦钾RS（P/N：1370462）用40/60的甲醇/水配制为浓度0.25 mg/mL的标准溶液。
方法条件
原始各论中指定使用4.0 × 250 mm, 5 µm色谱柱。方法已放大为使用4.6 × 250 mm, 5 µm色谱柱，并相应调整了进样体积和流速。
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液相色谱系统： |
Alliance iS HPLC System 系统X HPLC系统 系统Y HPLC系统 Alliance e2695系统 Arc HPLC系统 |
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分离模式： |
等度 |
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检测： |
所有系统均采用紫外检测（254 nm，10点/秒） |
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样品瓶： |
TruView pH控制LCMS认证透明玻璃23 × 32 mm螺纹口样品瓶，配有瓶盖和预开口PTFE/硅胶隔垫，2 mL体积，100个/包（P/N：186005666CV） |
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色谱柱*： |
XSelect™ CSH™ C18 4.6 × 250 mm, 5 µm（P/N：186005291） |
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柱温： |
35 °C |
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样品温度： |
15 °C |
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进样体积*： |
13.2 µL |
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流速*： |
1.32 mL/min |
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流动相： |
乙腈/0.1%磷酸水溶液(40/60) |
注：氯沙坦钾含量测定方法已于2021年8月由USP更新，将样品稀释剂由100%甲醇改为40/60的甲醇/水溶液1,8。
USP各论中的非诺贝特分析
样品描述
将USP非诺贝特RS（P/N：1269447）用70/30的乙腈/水配制为浓度1 mg/mL的标准溶液，并用磷酸将其酸化至pH 2.5。
方法条件
原始各论中指定使用4.0 × 250 mm, 5 µm色谱柱。方法已放大为使用4.6 × 250 mm, 5 µm色谱柱，并相应调整了进样体积和流速。
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液相色谱系统： |
Alliance iS HPLC System 系统X HPLC系统 系统Y HPLC系统 Alliance e2695系统 Arc HPLC系统 |
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分离模式： |
等度 |
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检测： |
所有系统均采用紫外检测（286 nm，10点/秒） |
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样品瓶： |
TruView pH控制LCMS认证透明玻璃23 × 32 mm螺纹口样品瓶，配有瓶盖和预开口PTFE/硅胶隔垫，2 mL体积，100个/包（P/N：186005666CV） |
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色谱柱*： |
XSelect™ CSH™ C18 4.6 × 250 mm, 5 µm（P/N：186005291） |
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柱温： |
25 °C |
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样品温度： |
15 °C |
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进样体积*： |
6.6 µL |
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流速*： |
1.32 mL/min |
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流动相： |
乙腈/用磷酸酸化至pH 2.5的水(70/30) |
USP各论中的酮康唑分析
样品描述
将USP酮康唑RS（P/N：1356508）用100%甲醇配制为浓度0.1 mg/mL的标准溶液。
方法条件
原始各论中指定使用4.6 × 100 mm, 3 µm色谱柱。方法已放大为使用4.6 × 100 mm, 3.5 µm色谱柱，并根据指示调整了流速和梯度。
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液相色谱系统： |
Alliance iS HPLC System 系统X HPLC系统 系统Y HPLC系统 Alliance e2695系统 Arc HPLC系统 |
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分离模式： |
梯度 |
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检测： |
所有系统均采用紫外检测（225 nm，10点/秒） |
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样品瓶： |
TruView pH控制LCMS认证透明玻璃23 × 32 mm螺纹口样品瓶，配有瓶盖和预开口PTFE/硅胶隔垫，2 mL体积，100个/包（P/N：186005666CV） |
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色谱柱*： |
XBridge™ Shield RP18 4.6 × 100 mm, 3.5 µm（P/N：186003044） |
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柱温： |
25 °C |
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样品温度： |
15 °C |
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进样体积： |
10 µL |
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流速*： |
1.71 mL/min |
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流动相A： |
乙腈/3.4 mg/mL四丁基硫酸氢铵水溶液(5/95) |
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流动相B： |
乙腈/3.4 mg/mL四丁基硫酸氢铵水溶液(50/50) |
梯度表
数据管理
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色谱软件： |
Empower™ 3.7 |
结果与讨论
Alliance iS HPLC System和同类HPLC系统的性能
为评估Alliance iS HPLC System和同类HPLC系统的性能，本研究中运行了四种USP分析方法，并比较了标准溶液峰面积的%RSD。每种方法均连续运行三天，以模拟高通量环境中的系统稳定性。所有HPLC系统在第1天分析前均已完成管路灌注与清除操作。HPLC自动进样器的特性和缺省设置如表1所示。
标准溶液分装后冷藏保存直至使用。每天使用未刺穿的标准溶液样品瓶，以尽量减少样品稀释剂挥发的影响。每天对进行三个样品组的分析，每组包含N=6次重复进样（总计N=18次进样）。根据需要穿插添加空白稀释剂进样，以确保HPLC系统不间断运行。评估每个样品组的峰面积相对标准偏差(RSD)并作图。比较各套HPLC系统的进样精度性能，验证系统能否始终如一地满足严格的精度要求。
在规定方法中，自动进样器的吸取速度通常不是指定参数。因此，许多用户通常此方法参数保留为仪器缺省值。然而该设置可根据实际分析需求进行优化。例如，在高通量环境中，提高吸取速度有助于缩短分析时间。较快的吸取速度虽然可以缩短运行周期，但可能会对峰重现性产生不利影响（如处理粘性样品的情况）4。 本研究中，各系统保持仪器缺省吸取速度（表1）。
本研究涉及的HPLC系统使用不同的样品抽吸机制：采样注射器和计量装置（表1）。图1通过抽吸/进样阶段展示了机制之间的差异。Arc HPLC系统采用注射器设计，由低压注射器抽吸样品（图1A）。进样样品后（图1B），注射器与高压流路分离，这种设计可能导致运行过程中积聚空气。
采样注射器的一个潜在缺点是可能积聚空气。积聚的气体会影响自动进样器的准确度和精度，导致待输送的样品体积不正确、不一致。因此，在分析前灌注注射器非常重要。为解决这个问题，一些HPLC系统配备了单独的脱气清除溶剂，以便在系统启动时更有效地清除注射器中的空气2。
采样注射器的另一个潜在缺点是注射器吸取电机的精度。在老旧型号的HPLC系统上，注射器吸取电机的微调可能不够精细。这会影响低进样体积的准确度和精度。虽然使用不同的样品定量环和注射器尺寸组合可以缓解这个问题，但要为不同的分析更换这些组合，对于用户而言可能非常耗时。
Alliance iS HPLC System的计量装置在设计上解决了其中一些缺点。通过将计量装置设计在高压流路中（图1C），有效减少了空气积聚。样品进样后，计量装置始终作为流路的一部分，并被流动相持续冲洗（图1D）。这样可防止空气滞留在计量装置中。此外，控制计量装置的电机机制经过更加精细的调整，进一步提高了进样的准确度和精度。
USP氟康唑各论方法（20/80的有机溶剂/水溶剂）
氟康唑分析使用20%乙腈和80%水组成的主要为水相的样品稀释剂。该分析在所有系统上均具有高重现性，样品组峰面积RSD在0.02%~0.37%的范围内（图2）。此结果完全满足峰面积RSD不超过2.0%的要求。与配备采样注射器的系统（Alliance e2695系统和Arc HPLC系统）相比，配备计量装置的HPLC系统（Alliance iS HPLC System、系统X和系统Y）展现出更优异的精度表现，所有样品组的峰面积RSD均未超过0.2%。Alliance iS HPLC System的整体表现最佳，三日测试期间峰面积%RSD值在0.02%到0.05%之间。
USP氯沙坦钾各论方法（40/60的有机/水相）
氯沙坦钾分析使用40%乙腈和60%水组成的主要为水相的样品稀释剂。与氟康唑类似，该分析在不同系统之间具有高重现性，样品组峰面积%RSD值在0.01%~0.25%的范围内（图3）。所有系统均满足严格的峰面积RSD(0.5%)要求，不同抽吸机制之间的性能无明显差异。该方法早期版本曾由P.Hong（2020年）进行验证并证实存在挑战性，但USP的新版修订已将样品稀释剂从100%有机相调整为40/60有机相/水相混合体系2。 挥发性有机组分比例的降低，可能使HPLC系统更容易满足这一严格要求。
USP非诺贝特各论方法（70/30的有机相/水相）
非诺贝特分析以有机溶剂为主，样品稀释剂为70%乙腈和30%酸化水。由于稀释剂中有机物含量较高，预计样品的重复性会因挥发性而受到挑战。不过，该分析法在不同系统间表现出良好的重现性，样品组峰面积RSD在0.04%~0.43%之间（图4）。所有系统均满足峰面积的RSD小于1.0%的要求。Alliance iS HPLC System、系统X和Y以及Arc HPLC系统的性能均相似（峰面积RSD在0.04%至0.23%之间）。
Alliance e2695系统的分析难度更大，与其他系统相比，其峰面积%RSD值更高(0.10%~0.43%)。这可能是由于分析的进样体积较小(6.6 µL)。在缺省配置下，Alliance e2695系统使用250 µL采样注射器。大体积的采样注射器与小进样体积配合，会导致精度损失和峰面积%RSD增加。
USP酮康唑各论方法（100%有机相）
酮康唑分析完全采用100%甲醇作为有机样品稀释剂，进行全有机相分析。由于该方法严格的峰面积RSD要求 (0.73%)，各品牌HPLC系统均面临挑战。在测试的HPLC系统中，只有Alliance iS HPLC System能连续三日达标（峰面积RSD值在0.03%至0.18%之间）。其余四套HPLC系统均未能持续满足标准（图5）。其中，系统X与Arc HPLC系统的样品组间差异尤为显著。系统X的峰面积%RSD范围为0.06%~1.26%，而Arc HPLC系统则为0.12%~1.19%。系统Y持续产生较高的峰面积%RSD，范围在0.51%~1.18%之间。Alliance e2695系统的峰面积RSD值在0.17%~0.36%之间，但出现一组的RSD高达1.15%。
从酮康唑数据中无法确定与样品抽吸机制相关的明确趋势。尽管预期计量装置可提供优于采样注射器的进样精度，但此次结果并不明确。Alliance iS HPLC System与系统X和系统Y的精度性能并无一致趋势，系统X和系统Y在大多数样品组中未能达到精度标准。
为了确定可能影响自动进样器性能的其他因素（例如样品稀释剂和进样器吸取速度），我们评估了从采用计量装置的系统收集的数据。酮康唑分析使用100%甲醇作为样品稀释剂，其挥发性较高。在整个研究过程中，样品室温度控制在15 ℃，以尽可能减少样品挥发。每天使用未刺穿的标准溶液样品瓶（N=18，所有进样均来自同一样品瓶）。由于使用后标准空白样在所有HPLC系统上均未检测到残留峰（图6），因此排除了残留作为峰面积增加的原因。如果稀释剂挥发是影响峰面积差异性的主要因素，则酮康唑的绝对峰面积会随时间推移而增加，因为稀释剂挥发会导致样品溶液的浓度升高。
图7展示了Alliance iS HPLC System、系统X和系统Y上N=18次进样获得的酮康唑绝对峰面积数据。总体而言，Alliance iS HPLC System在两次进样之间的峰面积差异最小。在Alliance iS HPLC System上分析得到的样品峰面积呈增加趋势（图7中的黄色迹线），表明存在样品挥发现象，但性能未受影响，且峰面积RSD较低 (0.03%~0.18%)。系统X和Y（图7中的橙色和蓝色迹线）没有表现出挥发趋势；其样品峰面积未持续增长，而是在高低值间波动，导致峰面积RSD较高。在整个测试过程中，峰面积波动间歇性地发生，表明样品挥发并非这两个系统峰面积差异的主要原因。
另一个需要考虑的因素是进样器吸取速度，它可能需要针对样品稀释剂进行优化。如表1所示，不同HPLC系统的缺省吸取速度值可能存在差异。Alliance iS HPLC System和系统Y的吸取速度为100 µL/min，系统X的吸取速度为300 µL/min。三套系统中，系统X的吸取速度最快，却也呈现出最大的数据差异。如果没有针对不同稀释剂优化吸取速度，可能会导致进样之间峰面积不一致。另一方面，Alliance iS HPLC System和系统Y的吸取速度均为100 µL/min，但两者的精度性能却截然不同。这表明进样器吸取速度及其对峰面积重现性的影响仍需进一步的研究。
结论
HPLC系统获取一致、可重现数据的能力至关重要，这要求自动进样器具有高性能。本研究考察了仪器特性（例如样品抽吸机制和进样器吸取速度）对HPLC性能满足精度要求的影响。自动进样器性能表现复杂，我们发现性能表现会随着方法和系统的不同而发生变化。计量装置使用调整得更精密的注射器吸取电机，且直接集成在高压流路中，因此在精度方面优于采样注射器。
在氟康唑和酮康唑的USP分析中，Alliance iS HPLC System的整体性能最优，峰面积%RSD最低。酮康唑分析的方法条件要求尤为严格，不同的HPLC系统产生的结果差异很大。Alliance iS HPLC System展现出优异的精度，在三天测试周期内均能获得一致且可重现的结果，满足严格的峰面积RSD要求(0.73%)。
采用计量装置的不同HPLC系统在酮康唑分析中出现了意料之外的显著差异。追踪每套系统上酮康唑的绝对峰面积后，排除了样品挥发和残留问题导致峰差异的可能性。此外，尽管两套HPLC系统的进样器吸取速度相同，但它们的性能差异很大。虽然抽吸机制和进样器吸取速度是重要因素，但它们尚不能完全解释我们观察到的自动进样器性能差异。
参考资料
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