将Alliance™ iS Bio HPLC System部署为QC环境中用于生物制药分析的现代化HPLC
摘要
采用MaxPeak™高性能表面(HPS)技术的Alliance iS Bio HPLC System是一种生物惰性LC，旨在减少生物制药生产环境中的表面/分析物相互作用。作为一款现代化的HPLC仪器，Alliance iS Bio HPLC System采用了沃特世创新型MaxPeak HPS技术、直观的触摸屏操作、旨在尽量减少错误的自动化运行前检查功能，以及Intelligent Method Translator App(iMTA)等功能。通过在生产环境中搭配使用这些功能，可实现方法现代化、节省资源并提高生物制药分析通量。本研究在常规QC检测环境中评价了Alliance iS Bio HPLC System在生物制药分析中的应用。本研究选择寡核苷酸作为测试案例，这是因为寡核苷酸是一种受到关注的新型模态，且容易受到分析物/表面相互作用的影响，因此认为寡核苷酸可能受益于Alliance iS Bio HPLC System的MaxPeak HPS技术。本研究观察到，与传统系统相比，寡核苷酸分离结果中的峰高增加了30%，峰面积增加了15%。此外，改用现代化色谱柱填料后，分析仅需过去三分之一的运行时间、溶剂和样品消耗量。这些结果表明Alliance iS Bio HPLC System非常适合作为QC环境中的新一代HPLC平台，用于生物制药的分析和常规检测。
优势
- Alliance iS Bio HPLC System能够在QC环境中发挥一致的性能。
- MaxPeak高性能表面可提高金属敏感分析物的回收率。
- Intelligent Method Translator App可减少方法转换错误并节省时间。
- Alliance iS Bio HPLC System可降低方法缩放后的运行成本并减少浪费。
简介
过去十年来，生物制药领域用于癌症和罕见病的治疗药物稳步增加。这一成功的部分原因是此类药物能够针对疾病量身定制，同时尽可能地减少不良副作用，特异性和安全性都优于传统的治疗方法。寡核苷酸代表了生物制剂在疾病治疗中的前沿进展，其用途包括肌营养不良症、脊髓性肌萎缩症，以及最近用于控制COVID-19传播的疫苗1。 这些类型的细胞和基因疗法基于核酸相互作用，即通过碱性核苷偶联形成旨在引发细胞中专属性表达的序列。虽然合成程序已得到充分了解和控制，但监测和控制合成过程中形成的杂质至关重要。
为确保药品安全，生产环境中的支持实验室需要在放行前监测与药品相关的已知杂质或关键质量属性(CQA)。离子对反相色谱(IP-RPLC)是一种广泛用于分离寡核苷酸的技术2。 IP-RPLC技术基于寡核苷酸的磷酸盐骨架与吸附到固定相上的离子对试剂生成的带正电荷的胺之间的离子对，能够按大小有效分离寡核苷酸。但是，磷酸盐是一种已知的螯合剂，可以与金属形成络合物。这一点可能不利于寡核苷酸，因为骨架上带负电荷的磷酸基团容易与金属表面发生强烈的相互作用。此类相互作用可能导致色谱干扰，包括回收率降低、变异性增加和峰拖尾。这与QC实验室的期望背道而驰，因为他们希望方法耐用，能够及时提供一致的结果。在生产环境中，理想的做法是使用专为生物药物分析设计的LC平台尽可能减少这些相互作用，同时提供耐用的性能。
Alliance iS Bio HPLC System沿用了Alliance iS HPLC System的创新设计，是针对这些棘手模态的Waters™解决方案。Alliance iS Bio HPLC System是一款生物惰性HPLC系统，专为生物制药生产环境而设计。这款创新的HPLC平台在设计时采用生物惰性流路，整个系统均配备生物兼容性组件，并采用MaxPeak HPS技术，使其成为生物制药应用质量控制实验室的理想选择。该系统支持MaxPeak Premier色谱柱，可以在生物制药样品的分析和常规检测中提高分离度，提高灵敏度并减少峰拖尾3。 这些功能的组合运用可实现高效的方法开发，同时提供一致可靠的结果。
本文通过分析两种样品：寡核苷酸标准品(OST)和完全硫醇化硫代磷酸酯(PS)寡核苷酸样品(GEM91)，评价了Alliance iS Bio HPLC System的潜在优势4。 在传统平台与作为现代化HPLC平台的新型Alliance iS Bio HPLC System之间进行了比较分析。
实验
对Alliance iS Bio HPLC System与传统系统进行了性能比较。MassPREP™寡核苷酸标准品(OST)包含1 nmol的15、20、25、30和35 mer寡聚脱氧胸苷（P/N：186004135）。将样品瓶内容物溶于250 µL去离子水中，最终浓度为4 pmol/µL。将10 µL该样品(40 pmol)进样至色谱柱。GEM91是25 mer完全硫醇化硫代磷酸酯(PS)寡核苷酸 CTC TCG CAC CCA TCT CTC TCC TTC T，MW 7776 Da。GEM91的进样浓度为0.5 mg/mL。
传统系统条件
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液相色谱系统： |
传统系统 |
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检测： |
UV/Vis 2489，λ=260 nm |
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色谱柱： |
XBridge™ BEH™ C18, 5 µm, 130Å, 4.6 mm X 100 mm,（P/N：186003115）; XBridge BEH C18, 2.5 µm, 130Å, 4.6 mm X 100 mm,（P/N：186006039） |
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柱温： |
60 ℃ |
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样品温度： |
5 ℃ |
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进样体积： |
10 µL |
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流速： |
0.65 mL/min（用于OST），0.50 mL/min（用于GEM91） |
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流动相： |
A：25 mM HAA水溶液(pH = 7.0) B：25 mM HAA，溶于水/ACN=40/60，PH=7.0 C：水 D：乙腈 |
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色谱软件： |
Empower™ 3, FR4 |
Alliance iS Bio HPLC System条件
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液相色谱系统： |
Alliance iS Bio HPLC System |
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检测： |
TUV，λ=260 nm |
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色谱柱： |
XBridge Premier BEH C18寡核苷酸分析专用柱，2.5 µm, 130Å, 4.6×50 mm（P/N：186009901；+eConnect部件号：186009901RF）； 2.5 µm, 130Å, 4.6×100 mm（P/N：186009902；+eConnect P/N：186009902RF）； 2.5 µm, 130Å, 4.6×150 mm（P/N：186009903；+eConnect P/N：186009903RF） 注：Empower 3.8.0可实现色谱柱追踪的全部优势 |
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柱温： |
60 ℃ |
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样品温度： |
5 ℃ |
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进样体积： |
OST为10 μL；对于GEM91，50 mm色谱柱的进样体积为10 μL，100 mm色谱柱的进样体积为20 μL，150 mm色谱柱的进样体积为30 μL。 |
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流速： |
OST为0.65 mL/min；对于GEM91，5 μm色谱柱的流速为0.50 mL/min，2.5 μm色谱柱的流速为1.00 mL/min |
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流动相： |
A：25 mM HAA水溶液(pH = 7.0) B：25 mM HAA，溶于水/ACN=40/60，PH=7.0 C：水 D：乙腈 |
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色谱软件： |
Empower 3.8.0 |
用于Waters MassPrep OST分析的梯度表
用于GEM91分析的梯度表
结果与讨论
MaxPeak HPS技术在寡核苷酸分析中的优势
在LC分离中，由于磷酸盐骨架的螯合特性，寡核苷酸存在回收率低的问题。因此，为了提高分析物回收率以用于分析，必须对表面进行冗长的钝化处理。作为生物惰性设计的一部分，Alliance iS Bio HPLC System采用MaxPeak HPS技术，以减少分析物/表面相互作用（包括寡核苷酸分析中遇到的相互作用）。为评估Alliance iS Bio HPLC System在这方面的表现，我们比较了两个系统上寡核苷酸标准品的回收率：一个是传统系统，配备2.5 µm, 130 Å, 4.6 × 100 mm XBridge BEH C18色谱柱，另一个是Alliance iS Bio HPLC System（现代化HPLC），配备2.5 µm, 130 Å, 4.6 × 100 mm, XBridge Premier BEH C18 寡核苷酸分析专用柱。每个系统均进行20次MassPrep OST标准品进样。使用乙酸己基铵(HAA)作为离子对试剂。流动相为25 mM HAA（pH 7），分别使用水溶液（流动相A）以及水与乙腈的混合物（流动相B）配制。如图1所示，配备MaxPeak Premier寡核苷酸分析专用柱的Alliance iS Bio HPLC系统在用于寡核苷酸分析时表现出显著改善。具体而言，以20 nt峰作为完全分离峰的代表，峰高平均增加30%（图1A），峰面积平均增加14%（图1B），表明灵敏度和回收率均得到提升。此外，Alliance iS Bio HPLC System在更短的时间内实现了更高的回收率，从而省去了冗长的钝化程序。这一效率提升得益于Alliance iS Bio HPLC系统和色谱柱的生物惰性，其中MaxPeak HPS技术有效减少了寡核苷酸的磷酸盐骨架与系统和色谱柱硬件的金属表面之间的非吸附螯合，进而提高了分析物回收率。
将方法从传统HPLC系统迁移至Alliance iS Bio HPLC System
确认生物惰性表面的优势后，我们分析了一种完全硫代寡核苷酸候选治疗药物GEM91，从而通过更具代表性的行业样品进一步研究Alliance iS Bio HPLC System的性能。尽管GEM91作为原料药已经进行了精制，但其中仍然含有需要监测的痕量杂质。为了比较仪器，两个系统采用了相同的方法和相同的色谱柱。为协助用户完成方法转换，Alliance iS Bio HPLC System允许用户使用Intelligent Method Translator App(iMTA)，以此加快方法转换过程并减少抄录错误。在本研究中，使用iMTA（图2A和2B）从传统系统中导出方法条件，并在Alliance iS Bio HPLC System中重新创建方法。如数据所示，使用传统HPLC方法的代表性填料产品（5 µm, 130Å, 4.6 × 100 mm）时，可以顺利地在Alliance iS Bio HPLC System（图2D）上重现传统方法的色谱图（图2C）。进一步放大杂质曲线（鉴定为峰1-3）后，我们观察到，Alliance iS Bio HPLC System的集成式MaxPeak HPS将痕量杂质的信噪比提高了多达40%。在分析先进疗法的关键物质（例如寡核苷酸）时，这一改进可提高回收率和准确度。
方法现代化
作为一款现代化HPLC仪器，Alliance iS Bio HPLC System能够承受高达10,000 psi的压力，让用户能利用现代化色谱柱技术的优势来节省资源并提高通量。该技术的特点是粒径和色谱柱内径更小，旨在提高分离效率。为证明这一点，使用沃特世方法转换器，将方法从5 µm粒径、4.6 mm内径的传统色谱柱形式缩小至采用更现代化的2.5 µm粒径固定相。测试了50 mm、100 mm和150 mm的柱长以评估放大优势。如图3所示，随着粒径变小，色谱柱对GEM91及其相关杂质保持良好的峰选择性。这是根据四个杂质峰列出的相对保留时间确定的。方法现代化不仅能够保持经验证方法的选择性，而且还带来了新的优势。将色谱柱柱长从150 mm缩短至50 mm后，分析时间、样品和溶剂消耗量也降低至过去的三分之一，反映了Alliance iS Bio HPLC System的经济有效。
方法现代化
Alliance iS Bio HPLC System的价值远不止于支持现代化色谱柱填料。Alliance iS Bio HPLC System在系统设计中融入了四元溶剂管理器，有助于QC实验室更高效地优化方法。方法确认和验证通常涉及一定程度的开发和优化。该过程可能需要多次制备样品和使用流动相，在此过程中以逐步方式测试条件。作为一个迭代过程，这可能会导致运行成本增加、浪费时间和溶剂。Alliance iS Bio HPLC System配备四个流动相储液瓶，可实现四元溶剂混合，从而提高方法优化的灵活性和效率。为证明这一点，我们制备200 mM的HAA浓缩储备液作为流动相A，并用水和乙腈配置为流动相C和D，以控制HAA浓度并实现梯度。通过在50%至12.5%范围内调整流动相A，即可使用单一流动相制剂有效评估25 mM-100 mM范围内的HAA浓度。例如，图4显示了在所有运行中乙腈含量从5%（流动相D）开始增加，以探索最佳HAA浓度，以便在该梯度内洗脱GEM91寡核苷酸（用箭头指示）。在本例中，HAA的浓度为100 mM时，寡核苷酸在梯度结束时洗脱，因此浓度过高。此外，已确认最终乙腈浓度不足以洗脱寡核苷酸后面的一些流动相杂质。在本例中，降低离子对浓度可节省试剂用量并更好地控制梯度展开空间。因此，确定25 mM HAA作为离子对浓度足以在梯度空间内洗脱寡核苷酸，同时仍支持进一步优化方法。
在25 mM条件下（流动相A=12.5%），使用相同的流动相制备方法对峰选择性进一步优化。该方法不仅节省了实验台操作时间，还减少了溶剂用量和废液产生量，减少了实验对环境的影响。采用流动相D优化梯度斜率，提高杂质与主峰之间的分离度。如图5D所示，使用11 min的梯度从5% D/min优化至1.36% D/min，可以提高杂质（峰1~4）之间的分离度，同时保持总运行时间相对较短(25 min)。
使用经优化的条件，在2.5 µm, 130Å, 4.6 × 50 mm, XBridge Premier BEH C18寡核苷酸分析专用柱上，重复进样GEM91五次，评估方法重现性。如图6A所示，五次重复进样的叠加图证明，Alliance iS Bio HPLC System能够快速提供一致的结果。如图6B所示，杂质峰(1~4)的保留时间RSD小于0.05%，峰面积百分比RSD小于3%。总体而言，该方法可以帮助用户降低总体运行成本，并开发环保型生物制药分析方法，从而使用更少的溶剂和试剂获得一致且耐用的结果。
结论
本研究的结果表明，Alliance iS Bio HPLC System非常适用于寡核苷酸等生物制药分析，能够很好地满足生产环境中实验室当前和未来的需求。通过将Alliance iS Bio HPLC System与XBridge Premier寡核苷酸分析专用柱结合使用，寡核苷酸polyT标准品的峰回收率提高了15%，代表性寡核苷酸样品(GEM91)中杂质的信噪比提高了40%。在五次重复进样中，GEM91样品的杂质峰面积百分比的相对标准偏差(RSD)小于3%，证明了该系统的性能。Alliance iS Bio HPLC System的四元溶剂管理器能够快速高效地探索方法条件，证明了Alliance iS Bio HPLC System在降低生物制药分析成本和节省时间方面的优势。
参考资料
- Ziyi Chen, Zhiliang Liu, Yali Feng, Aochen Shi, Liqing Wu, Yi Sang, Chenxi Li, Global research on RNA vaccines for COVID-19 from 2019 to 2023: a bibliometric analysis.Sec.Vaccines and Molecular Therapeutics, Volume 15–2024.
- Koshel BM, Birdsall RE, Yu YQ.Improving Recovery and Quantitation of Oligonucleotide Impurities Using ACQUITY Premier with MaxPeak HPS Technology.Waters Application Note 720007238.April 2021.
- Martin Gilar, Zhimin Li, Jason MacLean.使用ACQUITY Premier BEH C18寡核苷酸分析专用柱改善寡核苷酸的色谱分析性能.沃特世应用纪要, 720007012ZH.2023年8月.
- Kathryn Brennan, Mary Trudeau, Michael Donegan, Paul D. Rainville.使用MaxPeak高性能表面技术改善寡核苷酸的SPE-LC-MS分析性能.720007019ZH，2020年9月.
720008288ZH，2024年4月
