高效液相色谱(HPLC)是一种常见的、文献记载充分的、且易于使用的方法，可用于分析多种化合物。HPLC发挥重要作用的领域之一是制药行业。仿制药公司和许多质量控制团队都使用HPLC系统和方法，因为与新技术（例如超高效液相色谱(UPLC™)）相比，HPLC系统和方法使用更方便。近年来，业界一直在努力提高分析化学技术（如HPLC）的可持续性。这些“环保”倡议都侧重于减少有毒试剂的使用、减少废弃物和能源消耗，同时仍然获得预期的科学结果。

本应用纪要考察了利伐沙班及相关杂质分析的USP各论方法。我们基于环保原则在内部开发了一种新方法。使用分析方法环保性评分(AMGS)法评估所有方法并评分，然后列出评分。内部开发的新方法得分比USP专论方法更优，因此更环保。

优势

• 开发一种新的、更环保的HPLC方法，用于分析USP专论中所述的利伐沙班及杂质
• 以AMGS指标来评估分析方法的可持续性
• 比较两种方法的AMGS评分

高效液相色谱(HPLC)的应用已有大量文献记载，并且在某些科学界中广为人知。许多行业严重依赖液相色谱(LC)来实现目标，无论是放行制剂药、监测患者健康状况，还是开发新型包装材料。HPLC在制药、食品、环境、材料科学、学术和生物分析工作流程中都有不同程度地普及。制药行业是充分利用这项成熟技术的行业之一，尤其是在质量控制领域。这项技术使用方便，加上多年的经验积累，是制药行业的理想选择。虽然HPLC使用起来非常高效，但它仍然存在一些缺点，例如与UPLC等新技术相比总体通量较低，并且会产生大量废弃物。随着“环保”倡议在全球蓬勃发展，后一个问题近来备受关注。提高HPLC方法的可持续性不仅可以减少对环境和人类健康的负面影响，还可以降低成本。

HPLC等分析技术的“环保性”评估有几个评分指标，其中一种方法是“分析方法环保性评分(AMGS)”，由来自多家制药公司的科学家于2019年提出¹。 该方法考虑了仪器的能源用量、运行时间和进样次数，首先计算“仪器能源评分”。接下来，考虑总溶剂体积、溶剂密度和溶剂能源需求，计算“溶剂能源评分”，此评分衡量溶剂生产和处置所消耗的能量。最后，根据溶剂体积、溶剂密度和EHS（环境、健康和安全）平均值（由计算器通过未知方法确定），计算溶剂EHS评分。然后合并三项评分即可得到环保性评分，分数越低，表明方法越环保。此外，AMGS方法还会指示每项评分在环保性评分中所占的百分比，以便进一步改进方法的各个方面，例如转移到运行能耗更低的分析系统。计算器可以使用美国化学会绿色化学研究所网站上提供的免费在线工具²。

本应用纪要重点介绍对利伐沙班及杂质分析的USP专论方法所做的改进。利伐沙班以商品名Xarelto出售，用于治疗和预防血栓，特别是深静脉血栓和肺栓塞，还可用于防止在重大手术后（如膝关节或髋关节手术）形成血栓。该化合物的含量测定和杂质分析使用经过验证的USP专论方法，该方法使用了磷酸钾和己烷磺酸钠。这两种添加剂用于流动相中，因此被视为分析的废弃物。此外，己烷磺酸钠用作离子对试剂会在HPLC系统中产生很大问题，因为需要冲洗系统进行去钝化处理，如果处理不当可能需要很长时间才能去除这种添加剂。本研究开发了一种新方法来分离USP专论中所列的利伐沙班及四种杂质。在USP专论方法条件以及新开发的方法条件下，都应用了AMGS方法，并使用在线工具生成评分²。

样品描述

使用40:60 v/v水:乙腈作为稀释剂，制备利伐沙班及相关化合物的储备液，浓度均为1 mg/mL。将储备液分别稀释至0.5 mg/mL（利伐沙班）和10 µg/mL（相关化合物B、D、G、J）。 

利伐沙班及杂质的方法开发

利伐沙班及杂质的USP专论方法规定，在流动相中使用磷酸钾和己烷磺酸钠以及甲醇和乙腈这两种强溶剂³。虽然该方法可能适用于分析活性成分利伐沙班及其合成杂质，但所述的流动相组成不够理想。该方法不仅需要通过多个步骤来制备流动相，而且己烷磺酸钠作为一种离子对试剂，在新系统上的活化时间也很长。此外，离子对试剂可能会使金属表面钝化，导致系统污染，因此致使这种添加剂很难去除。解决这一问题基本上需要专用的分析系统，因为交换流动相体系并非易事。除上述问题外，USP专论方法由于每次进样需要较高流速和较长的分析时间，不符合可持续理念。因此，开发出更符合可持续理念的方法，使用更容易制备的流动相，不仅可以减少对环境的影响，还能减少流动相配制过程中出错的可能性。为此，本研究开发了一种新方法，用于分离USP各论中规定的利伐沙班与四种杂质。

首先通过简单的筛选梯度（有机相从5%增加至95%）来探索分离五种分析物所需的条件。虽然乙醇明显不是方法的首选，但我们选择它作为强溶剂。这样选择是因为，乙醇可通过植物发酵而非石化工艺制得，因此被视为一种可再生溶剂，更符合可持续理念。选择XSelect Premier HSS T3色谱柱，因为这款色谱柱的MaxPeak™ Premier硬件采用了MaxPeak高性能表面(HPS)技术，可减少分析物与LC系统和色谱柱的金属组件之间发生非特异性吸附⁴。 如果分析物容易受到这种非特异性吸附效应的影响，可以使用MaxPeak Premier色谱柱消除这种相互作用，提供更准确和可重现的结果。降低新方法开发过程中的风险对于早日找到答案和避免未来的问题至关重要。图1为使用XSelect Premier HSS T3色谱柱分析利伐沙班和杂质样品重复三次进样得到的堆叠图，使用乙醇从5%增加到95%的线性梯度，斜率为每柱体积3%的乙醇。该方法未使用流动相添加剂。

该方法不仅满足所有分析标准（不包括灵敏度，未测试），分析时间也更短。USP专论方法规定的梯度时间为37分钟，还不包括重新平衡的时间。新开发的方法运行时间为25分钟，总体通量提高。这一改进直接转化为分析生产率的提升，同时还节省了分析成本和流动相用量。此外，由于新的流动相体系仅使用水和乙醇，流动相制备时间显著缩短，并且制备过程操作起来更简单。与药典方法相比，这种新方法提高了通量，并将溶剂用量减少约63%。

我们可以计算这种新方法和原始USP专论方法的环保性评分。但是，在执行计算时，必须考虑一些与方法的预期用途有关的假设。由于该方法理论上可以取代USP专论方法，因此还必须考虑一些其他因素。例如，需要对样品进行重复进样以满足某些USP标准。具体而言，USP专论规定利伐沙班峰面积的%RSD不超过(NMT) 5%。因此，根据USP通则<621>，总共需要执行6次重复测定。此外，各论方法总共需要三个样品，包括标准品溶液和灵敏度溶液。因此，分析需要制备三种不同的样品，总共进样8次才能完成测试。该数值以及适用的流动相和梯度条件将应用于所有环保性评分的计算中（如果适用）。

以AMGS指标计算环保性评分

使用AMGS在线计算器时，要输入的第一个参数是技术。选择范围相当广泛，涵盖典型的分析技术，包括Prep LC、SFC、LC-MS和NPLC。USP专论和新开发的方法所采用的技术均为HPLC。计算器将应用适当的能耗速率来计算仪器能源评分。接下来输入整个分析的目标分析物数量和进样次数。USP专论条件和新开发的方法的这些值相同。目标分析物数量为五种，包括利伐沙班和四种杂质，满足专论要求的进样总数为8次。

计算器的下一步是处理仪器条件，包括溶剂组成、运行时间、流速和梯度条件。两种方法在这一步表现出显著差异。将之前讨论的差异输入计算器。此外，USP专论条件中列出的方法用时为37分钟，但不含色谱柱重新平衡的时间。在本次计算中，考虑到每次进样之间需要重新平衡，输入的运行时间为40分钟。该计算器的一个缺点是，它在计算溶剂能源评分或溶剂EHS评分时未考虑任何流动相添加剂。例如，USP专论方法要求使用己烷磺酸钠，而这种溶剂与甲酸相比，在安全性方面有不同的考量。不过，确实需要指定流动相中有机溶剂的组成比例。

接下来，计算器需要用户输入样品和储备液的相关信息。USP各论方法通常用于分析活样品，但在本研究中，只需要储备液。因此，活样品的值不相关。但是，仍需要在计算器中输入样品稀释剂、样品体积和活样品的样品制备次数。在本应用纪要中，由于没有测试活样品，因此将两个值都添加为0，即溶剂组成为100%水。计算器要求用户输入样品制备体积、储备液的数量，以及所用的稀释剂（水和乙腈的混合溶液）。在本应用纪要中，输入的标准品储备液制备体积为5 mL，共创建五种储备液，分别是利伐沙班和每种杂质。使用的稀释剂为乙腈:水(40:60)。

接下来，需要输入工作标准溶液的值。USP专论要求分析样品，但在本应用纪要中并未考察这一项。由于样品不需要重复进样，且只进样一次，因此在计算器中输入体积1 mL，制备1次，稀释剂为40:60乙腈:水。至此，我们获得了制备工作标准溶液所需的信息。接下来记录系统适用性样品。只需制备一次样品，所需体积1 mL，就足以满足重复进样的需求。这里也使用了40:60乙腈:水作为稀释剂。最后一条信息是制备灵敏度溶液需要的。虽然未展示，但本研究需要使用灵敏度样品。由于只需要进样一次，因此输入制备次数为1次，进样体积为1 mL。此标准品也使用了上面列出的标准样品稀释剂。输入所有信息后，即可计算总得分。表1所示为USP专论方法与新开发方法的AMGS评分。

该评分清楚地表明，新开发的方法比USP专论方法更符合可持续理念。与USP专论方法相比，新开发的方法不仅环保性评分降低约50%，各项单独的评分之间也存在显著差异。其中尤为明显的是溶剂能源评分，与USP专论方法相比，新方法的这项评分低得多。这可能是因为，USP专论方法使用的多种有机溶剂中，没有一种是“生物基”溶剂，而新方法仅使用了乙醇。需要注意的是，由于需要相同数量的分析物和样品并使用相同的仪器，因此两种方法之间仪器能源评分的差异与运行时间直接相关。

AMGS评分是一种衡量方法环保性的合适方式，但只有在方法获得预期的科学结果后，AMGS评分才能被视为决定性因素。AMGS评分可以成为在两种同样适用且都能获得预期科学结果的方法之间决策的一个重要因素。因此，首选新开发的方法，因为它不仅能够分离USP专论中列出的杂质，而且AMGS值低于原始USP专论方法。

许多工作流程都非常重视可持续性，包括但不限于合成化学和分析化学。改善分析方法的“环保性”有很多方式，包括使用生物基溶剂、减少废液产生和使用低功耗仪器。当然，除了方法的可持续性外，生成高质量、符合预期目标的数据也很重要，必须在两者之间取得平衡。许多传统HPLC方法使用的流动相添加剂在可持续性方面并不是最优秀的。此外，这些方法通常使用旧的色谱柱技术和仪器，产生大量废液，进一步降低了“环保性”。通过开发一种新方法，在满足分析需求的同时恪守环保原则，生成更符合可持续理念的方法。本应用纪要重点介绍如何开发一种新方法来分离USP各论中所列的利伐沙班及其杂质。AMGS评分是一项衡量分析方法可持续性的指标，比较新方法与USP专论方法的评分结果。恪守环保原则，可以开发出更符合可持续理念的方法，不仅降低运营成本，还将减少实验室对环境的影响。 

1. Hicks M, Farrell W, Aurigemma C, Lehmann L, Weisel L, Nadeau K, Lee H, Moraff C, Wong M, Huang Y, Ferguson P. Making the Move Towards Modernized Greener Separations: Introduction of the Analytical Method Greenness Score (AMGS) calculator.Green Chem.21 (2019) 1816
2. ACS Green Chemistry Institute Pharmaceutical Roundtable Website.Accessed 14-Feb-2024.
3. USP Monograph Rivaroxaban.https://online.uspnf.com/uspnf/document/1_GUID-80A96549-FD91-4801-8878-23D22A9616D5_2_en-US?source=Search%20Results&highlight=Rivaroxaban Accessed 8-Feb-2024.
4. Lauber M, Walter TH, Gilar M, DeLano M, Boissel C, Smith K, Birdsall R, Rainville P, Belanger J, Wyndham K. 沃特世公司. 白皮书 720006930ZH, 2020.