在临床研究中使用Xevo TQ Absolute分析血清中的游离睾酮
仅供研究使用，不适用于诊断。
摘要
本文介绍了一种分析血清中游离睾酮的临床研究方法，该方法使用平衡透析和Xevo™ TQ Absolute质谱仪，提供了出色的分析灵敏度。
该临床研究方法使用少量血清，并在平衡透析后进行液-液萃取。采用ACQUITY™ UPLC™ I-Class PLUS FL系统和ACQUITY BEH™ C18色谱柱分离睾酮，并在Xevo TQ Absolute质谱仪上使用多重反应监测(MRM)模式进行检测。所开发的方法只需使用200 μL血清，在1~500 pg/mL范围内表现出良好的分析灵敏度和选择性，整个范围内的精密度CV≤8.4%。
优势
- 仅用200 μL血清即可分析出游离睾酮(0.5 pg/mL)，具有出色的分析灵敏度
- 平衡透析时间短，只需两小时
- 制得的样品体积足够大，可在需要时重新分析
简介
过去，在临床研究中分析游离睾酮一直颇具挑战，主要是因为游离睾酮占睾酮总量的比例不到3%，给分析灵敏度带来了挑战，另外还因为平衡透析是一个复杂而耗时的过程。
不过，通过使用Xevo TQ Absolute和Thermo Scientific™的快速平衡透析(RED)插管和板，采用快速且受控的培养模式，这些挑战得以克服。本研究开发出一种具有高灵敏度、精密度和准确度的游离睾酮分析研究方法。
通过平衡透析程序将血清中的游离睾酮与结合睾酮分离，然后使用液-液萃取法将游离睾酮浓缩并净化到不同溶剂中。将最终提取物进样至ACQUITY UPLC I-Class PLUS FL系统，采用ACQUITY BEH C18色谱柱分离游离睾酮，并使用Xevo TQ Absolute质谱仪进行检测（图1）。
实验
样品描述
使用1.0 mg/mL睾酮有证标准物质(CRM)（Merck，英国）溶液和52.75 mM HEPES缓冲液（由1 M储备液稀释制成，pH调节至7.4）制备一系列校准品，浓度范围为1~500 pg/mL。
内部质控样品(QC)使用MSG4000处理血清（Golden West Biologicals，美国）、未处理血清和个体男性血清样品（BioIVT，英国）制备，浓度约为2.79、8.80和134 pg/mL。
使用100 µg/mL睾酮-13C3有证标准物质(CRM)（Merck，英国）溶液制备工作内标。
平衡透析
将RED装置的插管（Thermo Scientific，英国）放入RED装置的可重复使用底板（Thermo Scientific，英国）中。向基质腔室中加入200 μL血清，并向缓冲液腔室中加入400 μL 52.75 mM HEPES缓冲液（pH调节至7.40 ± 0.03）。用密封胶带（Thermo Scientific，英国）密封板，放入经过温度校准的37 °C定轨摇床中，以800 rpm混合2 h。
液-液萃取
取出RED装置的插管，使含有游离激素的透析液留在RED装置的可重复使用底板中。将300 μL透析液转移至2 mL微量离心管中，然后加入30 μL 1000 pg/mL睾酮-13C3的甲醇溶液。混合30秒（使用多管涡旋混合器，转速2500 rpm）后，加入1.5 mL甲基叔丁基醚，盖上管盖，振摇（2500 rpm，5 min），然后以16,100 g的离心力离心2 min。取1.3 mL上清液转移至干净的沃特世2 mL 96孔样品收集板（P/N：186002482）中，然后在40 °C下氮气吹干。最后加入70 μL 50/50 v/v流动相A:流动相B，用沃特世方孔盖垫（P/N：186002484）密封板，以2500 rpm振摇30 s，随后用于分析。
液相色谱条件
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色谱柱： |
ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱, 130 Å, 2.1 mm x 100 mm, 1.7 µm（P/N：186002352） |
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柱温： |
50 °C |
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样品温度： |
10 °C |
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进样体积： |
25 µL |
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进样模式： |
不充满定量环 |
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针大小： |
20 µL |
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样品注射器： |
250 µL |
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样品定量环： |
50 µL |
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流速： |
参见梯度表 |
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流动相A： |
0.2 mM氟化铵水溶液 |
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流动相B： |
0.2 mM氟化铵的甲醇溶液 |
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弱清洗液： |
5% (v/v) 甲醇的水溶液 |
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强清洗液： |
25/25/25/25 (v/v/v/v)乙腈/甲醇/IPA/水 |
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运行时间： |
4.5 min |
梯度表
质谱条件
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质谱系统： |
Xevo TQ Absolute质谱仪 |
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电离模式： |
ESI+ |
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毛细管电压： |
1.2kV |
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脱溶剂气温度： |
650 °C |
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离子源温度： |
150 °C |
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脱溶剂气流速： |
1000 L/h |
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锥孔气流速： |
150 L/h |
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MS1分辨率： |
单位(0.7 Da) |
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MS2分辨率： |
单位(0.7 Da) |
MRM参数
方法事件
数据管理
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质谱软件： |
MassLynx™ v4.2软件(SCN 1042) |
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信息学软件： |
TargetLynx™ XS v4.2应用软件 |
结果与讨论
使用ACQUITY UPLC BEH C18, 130 Å, 2.1 mm x 100 mm, 1.7 µm色谱柱，实现了游离睾酮及其内标在背景噪音相对较低区域内的色谱保留。进样间的运行时间为5.3 min，相当于每小时分析11个样品。使用含25 pg/mL睾酮的50/50 v/v流动相A/流动相B溶液进行系统适应性测试，评估系统的分析灵敏度，并在分析之前确认色谱基线噪音较低。
在所有分析运行中，本临床研究方法均在0.5~650 ng/mL的范围内呈线性，r2 ≥ 0.995。未在空白样品中观察到来自500 pg/mL样品的明显残留。最终提取物可在样品管理器中于10 °C下稳定24 h。
将低浓度睾酮（0.20、0.25、0.30、0.40、0.50、0.75和1.00 pg/mL，溶于52.75 mM HEPES，pH调节至7.4）在五个分析批中重复进样十次(n=50)，进行分析灵敏度研究。研究结果表明，该方法的定量检测下限(LLMI)，即精密度≤20%且偏差≤15%时的浓度为0.5 pg/mL。结果见表1。
表1.LLMI总结
图2显示了空白52.75 mM HEPES缓冲液提取物、0.50 pg/mL提取物（代表LLMI）、1.00 pg/mL提取物（校准品1浓度）和5.00 pg/mL提取物的代表性色谱图，展示了该临床研究方法所达到的分析灵敏度。
图2.pH 7.4 52.75 mM HEPES缓冲液空白（黑色）、0.50 pg/mL LLMI提取物（绿色）、1.00 pg/mL校准品1提取物（紫色）和5.00 pg/mL提取物（红色）的代表性叠加色谱图，图中显示了使用峰到峰方法计算的信噪比(S:N PtP)。
通过三次重复萃取MSG4000处理血清，并在样品中加入低浓度和高浓度睾酮，利用加标后的样品定量评估基质效应。使用52.75 mM HEPES缓冲液（pH调节至7.4）以相同方式制备对照品。基于峰面积计算的基质效应在96%~102%范围内，RSD≤2.4%，表明既没有离子增强也没有抑制作用。
使用一系列高浓度内源性化合物（白蛋白、胆红素、胆固醇、肌酐、甘油三酯和尿酸）进行干扰测试。在一个游离睾酮浓度约为25 pg/mL的混合血清样品中，对供试品和对照品分别进行了三次重复分析。未观察到明显干扰，回收率在87.3%~114.5%范围内。结果汇总见表2。
表2.干扰测试总结
使用五个分析批，每种浓度重复测定五次(n=25)，评估该方法在低、中、高（2.79、8.80、134 pg/mL）血清游离睾酮QC浓度下的总精密度和重复性。总重现性和重复性为RSD≤8.4%。图3展示了这些精密度实验的结果。
图3.低、中、高游离睾酮浓度在五个分析批中计算的QC重复性和总精密度(%RSD)
为评估方法性能，本研究分析了购自英国NEQAS的45份男性血清样品，浓度范围为50.1~268.6 pg/mL，并将分析结果与所有实验室截尾均值(ALTM)进行了比较。同时对数据集应用Passing-Bablok回归和Bland-Altman一致性分析，以评估相较于ALTM值得到的性能。Passing-Bablok回归显示的方程为y=-2.869 + 0.947x，Bland-Altman一致性分析（图4）表现出-7.6%的小幅负平均偏差，总体一致性很强。
图4.英国NEQAS的45份男性游离睾酮样品的Bland-Altman一致性分析，总体平均偏差为-7.6%。
结论
我们开发了一种LC-MS/MS临床研究方法，使用平衡透析、ACQUITY UPLC I-Class PLUS FL系统和Xevo TQ Absolute质谱仪测定血清中的游离睾酮。该方法从200 μL血清中检出浓度低至0.5 pg/mL的游离睾酮，在需要时还可以对样品进行重新分析。
- 该方法表现出良好的线性，无明显残留、干扰或基质效应
- 该方法的总体重现性和重复性为RSD≤8.4%
- 该方法与英国NEQAS外部质量保证方案高度一致
最后，该方法快速高效，因为平衡透析步骤仅耗时2小时，且48个样品的全板制备时间不超过5小时。
720008237ZH，2024年2月
