改进常见β-2肾上腺素受体激动剂的HPLC-UV分离

β-2肾上腺素受体激动剂(BA)是治疗慢性呼吸系统疾病(CRD)的常用处方药。多年来，BA一直是十大处方药之一。本研究开发了一种在14 min内可重现地分离多种类型的BA和BA杂质的方法。我们考察了pH值对分析的影响。此外，我们还证明了MaxPeak™高性能表面(HPS)技术的高pH值稳定性和批次一致性。

优势

• 使用一种方法即可对多种BA及其杂质实现基线分离
• 该方法所用的碱性条件可使峰拖尾减少多达65%
• 通过该方法证明了MaxPeak™ HPS技术色谱柱和系统在高pH条件下的可靠性和重现性

有数据表明，全球有4100万人死于非传染性疾病。在这4100万患者中，有10%的患者死因是慢性呼吸系统疾病(CRD)¹。 哮喘和慢性阻塞性肺病(COPD)属于CRD²。 虽然CRD无法治愈，但患者可以使用维持性药物（例如β-2肾上腺素受体激动剂(BA)）来帮助缓解症状³。 BA可以进一步分为三类：短效B2激动剂(SABA)、长效B2激动剂(LABA)和超长效B2激动剂(ULABA)。鉴于CRD的患病率较高，舒喘宁等BA类药物多年来一直位居处方药排行榜前10位也就不足为奇了⁴。

目前针对BA的一些LC方法在酸性反相条件下分析这些化合物时会出现明显的拖尾^5,6。 但是，有证据表明高pH条件可以改善BA的整体色谱分析⁷。 另一个问题是，缺乏可涵盖多种BA的全面方法。因此，我们开发了一种高pH反相方法用于分离BA组。该方法可在14分钟内完成6种BA及其部分杂质的分析，并获得可重现、线性和灵敏的结果。此外，我们使用该方法比较了不同批次的色谱柱吸附剂，证明采用MaxPeak™高性能表面(HPS)技术的Premier色谱柱和系统具有可靠且稳定的性能，尤其是在高pH条件下。

分离方法的样品描述

购买各种BA以建立包含SABA、LABA和ULABA的完整BA组。左沙丁胺醇购自Sigma Aldrich（宾夕法尼亚州阿伦敦）。吡布特罗购自Toronto Research Chemicals（安大略省多伦多）。福莫特罗、茚达特罗、奥达特罗和维兰特罗购自Cayman Chemical（密歇根州安阿伯）。特布他林购自Santa Cruz Biotechnology（得克萨斯州达拉斯）。

称取各标准品放入20 mL闪烁瓶，并用去离子水:乙腈(95:5)稀释。考虑了含盐度校正和纯度。储备液浓度范围为0.5 mg/mL~1 mg/mL，具体取决于标准品溶解度。储备液储存于2 °C～8 °C下，并且可以在分析之前平衡至室温。

稀释储备液并混合，制得BA混合物样品。每种分析物的浓度均为100 µg/mL。

线性和杂质样品说明

线性和杂质标准品购自欧洲药品质量管理局(EDQM)（法国斯特拉斯堡）。购买的标准品如下：福莫特罗、福莫特罗杂质I、沙丁胺醇、沙丁胺醇杂质B、沙丁胺醇杂质D、沙丁胺醇杂质F、沙丁胺醇杂质G、特布他林和特布他林杂质C。

称取各标准品放入20 mL闪烁瓶，并用去离子水:乙腈(95:5)稀释。考虑了含盐度校正和纯度。储备液浓度范围为0.1 mg/mL~1 mg/mL，具体取决于标准品溶解度。储备液储存于2 °C～8 °C下，并且可以在分析之前平衡至室温。稀释储备液并合并，为每种主要分析物绘制不同的曲线点。进行杂质分析时，将分析物及其各自的杂质合并。每种杂质的浓度为10 µg/mL，分析物的浓度为100 µg/mL。

分离方法的结果

该方法在BA的保留和分离方面具有良好的重现性。在BA混合物样品的12次进样过程中，每种分析物的峰面积、保留时间和拖尾因子%RSD均<1%（表1、2和3）。下面的12次进样的叠加色谱图清楚地展示了方法性能（图1）。

pH 值的影响

众所周知，pH对大多数反相应用都有显著影响^7,8。 为研究其对BA的影响，我们使用碱性和酸性流动相A分析了相同的BA混合物样品。所用的碱性流动相为含有10 mM甲酸铵的去离子水，使用氢氧化铵将pH值调节为10。酸性流动相为含10 mM甲酸铵的去离子水，使用甲酸将pH值调节为3。

在碱性条件下，分析物的拖尾现象改善，并且对酸性条件下的关键分析物对 — 左沙丁胺醇和特布他林实现了基线分离。切换到碱性方法后，拖尾现象减少多达65%。下面是代表两种方法性能的数据表和色谱图（图2a和2b，表4和5）。

线性结果

我们还研究了每种EDQM分析物的线性。利用Empower 3中的校准功能进行线性拟合，计算每种分析物的线性。下图可以清楚地看出该方法的定量性能，表明该方法可用于质量控制检测（图3a-3c）。

杂质分析结果

此外，还考察了该方法对杂质分析的适用性。合并EDQM分析物及其各自的杂质，使杂质占主要分析物浓度的10%。下图展示了该方法分离分析物与杂质的能力，如图所示实现了基线分离和良好的灵敏度（图4a和4b）。

色谱柱批次重现性

为证明用于XBridge™ Premier BEH C₁₈色谱柱的色谱柱批次的一致性，考察了三个不同的生产批次。进样12次BA混合物样品，对每根色谱柱进行检测。毫无疑问，不同批次的性能相当（图5a至5c，表6和表7）。这些数据清楚地展示了XBridge™ Premier BEH C₁₈色谱柱的可靠性。

高pH条件下系统和色谱柱的重现性

为证明采用MaxPeak™ HPS技术的Premier色谱柱和系统在高pH条件下的适用性，我们在Arc™ Premier LC系统上安装了新的XBridge™ Premier BEH C₁₈色谱柱。该色谱柱可进样300次BA混合物样品，相当于运行时间超过100小时。300次进样的平均保留时间和标准偏差详细信息如下（表8）。

由于CRD的患病率和致死率较高，因此维持药物（例如BA）的质量和疗效至关重要。为支持这一点，我们开发了一种可以分离各种BA及其杂质的方法。结果具有良好的重现性和线性。在该方法的碱性条件下，峰拖尾减少多达65%，一些关键分析物对的基线分离也有所改善。此外，我们通过该方法证明MaxPeak™ HPS技术在碱性pH条件下长时间运行时具有良好的可靠性和重现性。最后，结果表明XBridge™ Premier BEH C₁₈色谱柱在不同的吸附剂批次中具有可靠的性能。

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4. Wirth J. The 50 most-filled prescriptions of 2022.The Checkup.SingleCare Administrators; 2022.Available from: https://www.singlecare.com/blog/most-prescribed-drugs-2022/#:~:text=Prescription%20drug%20use%20in%202022%20vs.%20previous%20years
5. Zhang L, Jia Q, Liao G, Qian Y, Qiu J. A Fast Method for the Simultaneous Analysis of 26 Beta-Agonists in Swine Muscle with a Multi-Functional Filter by Ultra-High Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry.Separations.2022 May 1;9(5):121.Available from: https://www.mdpi.com/2297-8739/9/5/121
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7. Alkhateeb FL, Wilson I, Maziarz M, Rainville P. Ultra high-performance liquid chromatography method development for separation of formoterol, budesonide, and related substances using an analytical quality by design approach.Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis.2021 Jan 30;193:113729.Available from: https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0731708520316150?viewFullText=true
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