在法医毒理学研究中使用简单的“稀释-上样”方法对尿液中的镇痛药物和滥用药物进行UPLC-MS/MS分析

本应用简报介绍了在法医毒理学研究中使用简单的“稀释-上样”方法进行镇痛药物和滥用药物的UPLC-MS/MS分析，并针对沃特世应用纪要720006187ZH中描述的方法提供了一种替代方案。样品前处理过程从SPE简化到只需一步稀释，与此同时仍能保持极低的残留、一致的基质效应和精确的定量数据，使组内大多数分析物都能达到所需的分析灵敏度。如果化合物对分析灵敏度的要求更高，则建议进一步净化样品，如原始应用纪要所述。

ACQUITY™ UPLC™ BEH™ C₁₈色谱柱可以快速分析大量化合物，同时保持所需的分离度，确保不受同分异构体化合物的干扰。

Waters™ Xevo™ TQ-S micro IVD能在较宽的动态范围内准确定量大量分析物，少至2 ng/mL，多至2500 ng/mL的分析物都能同时定量。

样品萃取、色谱分离与MS/MS检测相结合，得到一套简单的工作流程方法，既快速又精确，还可以在Hamilton STAR或STARlet系统上自动化运行。

优势

• 通过快速、简单的方法分析一组全面的确证药物
• 采用简单的“稀释-上样”样品萃取方法
• 一致的基质效应和回收率，残留极低
• 精确定量大量确证药物

在法医毒理学分析中，分析物组通常包括违禁药物和常见的滥用药物。通常，研究人员使用多种方法获取多种药物的全面信息。这些方法可包括免疫分析、GC-MS、LC-MS/MS或组合方法。沃特世开发了一种用于定量分析综合性药物组的方法，以获得适当的分析灵敏度、选择性和准确度，从而在法医毒理学中实现明确鉴定。

该方法采用“稀释-上样”方法和ACQUITY UPLC BEH C₁₈色谱柱，通过简单的样品萃取方案以及快速、可重现的色谱方法，使所有存在潜在干扰的关键分析物对均能实现基线分离。Waters Xevo TQ-S micro IVD质谱仪具有Xtended Dynamic Range (XDR)功能，能够提供多种化合物所需的分析灵敏度和动态范围。尽管该方法已被证明能够为镇痛药物和滥用药物提供合适的结果，但由于采用的是简化的“稀释-上样”工作流程，因此在分析灵敏度方面也存在一定局限性。如果只有少数分析物对分析灵敏度的要求不高，则建议进一步净化样品，如沃特世应用纪要720006187ZH中所述。

样品萃取

所有标准品均购自Cerilliant（Merck Life Sciences，英国吉林汉姆）、Toronto Research Chemicals（安大略省北约克）和Cambridge Biosciences UK（英国剑桥）。用甲醇配制浓度为2、10和25 µg/mL的混合储备液，具体取决于分析物种类。用50/50 (v/v)甲醇/水配制浓度为100 ng/mL的内标工作溶液。除氯硝西泮、去氢去甲氯胺酮、甲沙酮、去甲羟吗啡酮和α-吡咯烷戊苯酮(α-PVP)代谢物1外（这些化合物不容易获得稳定标记的内标），其余所有化合物均使用了稳定同位素标记的内标。稀释储备液，然后将稀释液添加到混合的空白尿液中，制备标样。同样，稀释储备液，然后将稀释液添加到混合的空白尿液中，制备质控(QC)样品。附录1列出了所有分析物的保留时间和标准曲线范围。

在样品萃取时，可以利用Hamilton液体处理机器人实现半自动化，使样品从样品管条形码到处理样品的每一个环节均可追踪。

取25 μL尿液样品转移至沃特世700 μL圆形96孔收集板中，加入内标工作溶液并充分混合。在进样到UPLC-MS/MS系统之前，用蒸馏水/甲酸溶液稀释并混合样品。

锥孔电压、碰撞能量和多重反应监测(MRM)通道等MS方法参数见附录1。

色谱分析

附录1中列出了所有测试目标化合物的保留时间窗口和标准曲线范围。图2显示了所有化合物的叠加色谱分离图，图3显示了几组可能相互干扰的分析物的色谱图，如下文所列。 

上述所有示例要么实现了基线色谱分离，要么采用了选择性MRM，因此这些化合物不会彼此干扰。由于本文所述的稀释法对样品净化的选择性较低，因此UPLC分离相较于应用纪要720006187ZH中略有修改。在梯度开始时设置一段临时保持时间，以便在分析物从色谱柱中洗脱之前，将盐和其他基质组分转移至废液。

每次分析均萃取两份七点标准曲线样品，较高浓度范围为25~2,500 ng/mL，中等浓度范围为10~1,000 ng/mL，较低浓度范围为2~200 ng/mL，详见附录1。所有标准曲线的相关系数(r²)均>0.99，至少75%的校正点在标称值的±15%范围内（标准曲线样品1为±20%），但N-去甲基佐匹克隆、去甲丙氧芬和佐匹克隆除外，这些化合物需要进一步研究，以确定在制备标准曲线样品时是否可以提高溶解度/稳定性。仅对N-去甲基佐匹克隆、去甲丙氧芬和佐匹克隆进行定性监测。

QC样品的较高浓度范围为25、75、187.5和1875 ng/mL，中等浓度范围为10、30、75和750 ng/mL，较低浓度范围为2、6、15和150 ng/mL，详见附录1。在运行的所有分析中，至少66%的QC样品在标称值的±15%范围内（QC1为±20%）。

精密度性能

在五个不同的条件下，每种QC样品（浓度如上所述）重复萃取和分析五次（n=25次重复分析），评估方法精密度。图4a-4d显示了每个QC浓度下获得的结果汇总。

分析灵敏度

在四个不同的条件下，萃取并分析浓度等于或低于标准曲线样品1的低浓度样品，每种样品10个重复样，计算%CV。大多数分析物的%CV < 20%，达到可接受标准。如果劳拉西泮、6-乙酰吗啡、α-羟基阿普唑仑、α-羟基三唑仑、纳洛酮、纳曲酮和普瑞巴林不符合可接受标准，但又要求更低的浓度，则建议采用沃特世应用纪要720006187ZH中所述的样品萃取方法。

残留

在比较六个空白基质样品的平均值与浓度为标准曲线样品7两倍浓度的样品时，除了7-氨基氯硝西泮和7-氨基氟硝西泮外，其余所有分析物均未观察到显著的残留效应；这两种物质的峰面积均为标准曲线样品1峰面积的38.8%。如需评估这些分析物达到残留效应可忽略的浓度，还需要进一步测试。

基质因子

在比较从六个不同供体提取的尿液样品与水溶液对照样品，以及低浓度和高浓度加标的样品时，除了苯丙胺和去甲羟吗啡酮之外，其余所有分析物的基质因子均在0.85~1.15之间（基质效应在15%以内）。所有分析物的基质因子数据汇总见附录2。

本应用简报介绍了法医毒理学研究中镇痛药物和滥用药物的UPLC-MS/MS分析概述。样品前处理流程简化为“稀释-上样”步骤，以便实施快速萃取技术。本研究所述的方法将UPLC分离与Xevo TQ-S micro IVD检测联用，能够分析大量镇痛药物和滥用药物。这个大型组中的大多数分析物都获得了高精密度的结果、一致的基质效应和极低的残留。但对于某些化合物，建议使用更彻底的样品萃取技术，以提高分析灵敏度，如沃特世应用纪要720006187ZH中所述。

1. Danaceau JP, Freeto S, Calton L. 结合简单快速混合模式的SPE与UPLC-MS/MS分析镇痛药物和滥用药物用于法医毒理学研究.沃特世应用纪要, 720006187ZH.2019年3月.
2. Rosano TG, Rumberger JM, Wood M. Matrix Normalization Techniques for Definitive Urine Drug Testing.Journal of Analytical Toxicology, 2021;45:901–912.