• 应用纪要

以更环保、成本更低的有机流动相溶剂用于完整生物治疗性蛋白质的LC-MS分析

以更环保、成本更低的有机流动相溶剂用于完整生物治疗性蛋白质的LC-MS分析
  • Henry Shion
  • Ying Qing Yu
  • Waters Corporation
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摘要

本应用纪要介绍了对蛋白质进行反相分离与质谱检测时，用更环保的III类、成本更低的液质联用(LC-MS)级醇（例如甲醇和异丙醇）替代乙腈（II类毒性）的最新趋势。本文报告了在生物制药的反相(RP) LC-MS分析中用异丙醇(IPA)替代乙腈的研究。本报告详细讨论了优点和潜在问题，但总体实验数据表明，IPA是在该应用领域中替代乙腈的可行替代品。 

优势

  • 异丙醇(IPA)是一种毒性低于乙腈的有机溶剂
  • 异丙醇(IPA)的成本低于乙腈
  • 在完整分子量分析与亚基LC-MS分析中，异丙醇(IPA)在峰形、残留和MS灵敏度方面表现良好

简介

本应用纪要介绍了在蛋白质RP LC-MS分析中使用更环保、更便宜的溶剂代替乙腈的最新进展。由于乙腈的紫外(UV)截止值和粘度均较低，因此广泛用于蛋白质的反相液相色谱(RPLC)分离，但它也带来了额外的挑战，例如毒性、废液处理和偶尔的稀缺。

随着人们不断追求更环保的LC有机流动相，乙醇或丙酮已成为代替乙腈(ACN)的热门候选1,2,3。 正如美国食品药品监督管理局(FDA)文件4–“Q3C–行业指南的表和清单”(Q3C–Tables and List Guidance for Industry)中所述，ACN在毒性方面被归类为2类溶剂，而乙醇和丙酮均被视为毒性较低的3类溶剂。对于RP LC-MS应用，Amgen尝试在流动相中使用IPA与0.1%三氟乙酸(TFA)进行蛋白分析5。本文报告了在生物制药的RP LC-MS分析中使用醇类（MeOH或IPA，也被归类为3类溶剂）取代ACN的研究。我们使用ACN、MeOH或IPA作为有机流动相溶剂（搭配常用的0.1%甲酸），通过完整单克隆抗体（NISTmAb参考标准品）及其IdeS酶解和还原亚基比较了这些溶剂的色谱和质谱性能。总体实验数据表明，IPA非常适合取代乙腈用于mAb的常规LC-MS分析。 

图1.本研究使用BioAccord™系统，包含一套ACQUITY™ UPLC™ I-Class PLUS系统，并将可变波长紫外检测器(TUV)与ACQUITY RDa™精确质谱检测器在线联用，在waters_connect™信息学平台下运行。

实验

标准物质和样品前处理

LC-MS级水、乙腈(ACN)、甲醇(MeOH)和异丙醇(IPA)购自Honeywell-Burdick & Jackson（美国密歇根州马斯基根）。LC-MS级甲酸购自Thermo Fisher Scientific（马萨诸塞州沃尔瑟姆）。本研究使用了沃特世人源化单克隆抗体(NISTmAb)质量数检查标准品（沃特世部件号=186009125）和沃特世单克隆抗体(NISTmAb)亚基标准品（沃特世部件号=186008927）。完整分子量分析：向含有80 µg完整mAb的样品瓶中加入400 µL水，制成0.2 µg/µL溶液，然后进样(4 µL)。亚基分析：向含有25 µg mAb亚基的样品瓶中加入250 µL水，制成0.1 µg/µL溶液，然后进样(4 µL)。 

BioAccord系统

系统：

ACQUITY UPLC I-Class PLUS

检测器：

ACQUITY RDa质谱检测器，TUV光学检测器

软件：

waters_connect v1.9.9.6

完整分子量分析 - LC-MS方法设置

色谱柱：

BioResolve™ RP色谱柱, 450 Å, 2.7 µm, 2.1 mm × 50 mm（部件号=186008944）

柱温：

80 °C

流动相A：

0.1%甲酸的水溶液

流动相B：

1. 0.1%甲酸的乙腈溶液，

2.95%甲醇的水溶液（含0.1%甲酸），或

3.95% IPA的水溶液（含0.1%甲酸）

TUV光学检测器：

UV 280 nm

完整mAb分析的液相色谱梯度表

总运行时间：7.0分钟。

完整分子量分析的MS条件

采集设置

模式：

全扫描

质量范围：

高(400-7000 m/z)

极性：

正

扫描速率：

2 Hz

锥孔电压：

自定义(70 V)

毛细管电压：

自定义(1.50 kV)

脱溶剂气温度：

自定义(550 °C)

智能数据捕获(IDC)：

关

亚基分子量分析的LC-MS方法设置

色谱柱：

BioResolve RP色谱柱, 450 Å, 2.7 µm, 2.1 mm × 50 mm（沃特世部件号=186008944）

柱温：

80 °C

流动相A：

0.1%甲酸的水溶液

流动相B：

1. 0.1%甲酸的乙腈溶液，

2.95%甲醇的水溶液（含0.1%甲酸），或

3.95% IPA的水溶液（含0.1%甲酸）

TUV光学检测器：

UV 280 nm

梯度表

总运行时间：5.50分钟

亚基分析的MS条件

采集设置

模式：

全扫描

质量范围：

高(400-7000 m/z)

极性：

正

扫描速率：

2 Hz

锥孔电压：

自定义(30 V)

毛细管电压：

自定义(1.00 kV)

脱溶剂气温度：

自定义(450 °C)

智能数据捕获(IDC)：

关

结果与讨论

乙腈(ACN)主要在丙烯腈制造过程中作为副产物产生，然后提纯制成。MeOH是由一氧化碳和氢气合成气体产生的，然后蒸馏制成。IPA是通过水合反应将水和丙烯结合，然后进行共沸蒸馏制成的6,8,9,10。由于生产工艺的差异，与ACN的生产相比，醇类的生产通常会产生纯度更高、污染物更少的溶剂。因此，在LC-MS分析中使用高纯度醇类的成本明显低于ACN。我们从当前美国市场上的众多供应商中选择了三个供应商，在表1中展示了IPA、MeOH和ACN之间的商业成本比较。ACN的平均成本接近MeOH和IPA平均成本的3倍，醇类明显更具成本优势。 

表1.LC-MS级有机溶剂流动相价格比较（2021年第四季度美国标价）

完整分子量分析

在完整分子量分析评估中，将0.8 µg沃特世人源化单克隆抗体(NISTmAb)质量数检查标准品上样到Waters BioResolve RP色谱柱。实验使用的流动相是A：0.1% FA的水溶液，B：0.1% FA的IPA（水溶液）、95% MeOH或95% ACN。使用优化的反相完整分子量分析梯度，总运行时间为7分钟。ACN和水的UV截止值均为190 nm，而MeOH和IPA的UV截止值均为205 nm7。 由于完整分子量分析和亚基分析使用的TUV波长通常为280 nm（对于小分子蛋白有时为260 nm），MeOH和IPA的TUV截止值相对偏高应该不会对TUV检测产生任何影响。

图2比较了使用三种流动相B对NISTmAb进行完整LC-MS分析的总离子流色谱图(TIC)和UV吸光度色谱图。三种有机流动相均在UV和MS谱图中产生对称且窄的峰（偏移保留时间与预期一致）。然而，测量显示IPA、MeOH和ACN的TIC半高峰宽分别为3.6、4.8和3.6秒，表明IPA和ACN（作为流动相B）产生的TIC峰比MeOH更窄。此外，MeOH的TIC强度约为IPA或ACN的80%。比较结果表明，IPA可取代ACN用于完整NISTmAb分析。 

图2.不同流动相条件下NISTmAb完整分子量分析的TIC和UV色谱图

图3比较了三种流动相溶剂用于NISTmAb完整分子量分析的组合原始谱图（图2中的TIC）（左），并展示了三个谱图的50+ 电荷态叠加图（右）。三种流动相在NISTmAb原始谱图中产生了相似的电荷包络。然而，放大后的50+电荷态叠加图显示IPA（黑色迹线）和ACN（蓝色迹线）产生的原始谱图在标称上优于MeOH，且糖型间的峰谷比更低（17%对20%，如图3所示）。NISTmAb的前五种糖型被鉴定为G0F/G0F、G0F/G1F、G1F/G1F、G1F/G2F和G2F/G2F6。糖型间的峰谷比较低通常表明质谱仪离子源中的脱溶剂过程较充分（去簇较充分）。因此，对于mAb完整分子量分析，观察到IPA和ACN产生比MeOH更好的谱图，尽管这种效果并不明显。 

图3.三种流动相（作为溶剂B）用于NISTmAb完整分子量分析得到的组合原始谱图比较（左），不同糖型的50+电荷态信号的三个去卷积谱图叠加显示结果相当（右）。

三种流动相的去卷积谱图产生了相当的谱图质量和质量精度（数据未显示）。前五种主要糖型（G0F/G0F、G0F/G1F、G1F/G1F、G1F/G2F和G2F/G2F）的相对MS响应（电荷去卷积后）与图4中显示的相似。图4是重复进样的相对MS响应在waters_connect软件中生成的汇总图。如图所示，IPA和ACN流动相具有相似的相对MS响应，而MeOH报告的结果略有不同。这一观察结果在其他mAb上得到验证，例如曲妥珠单抗和英夫利昔单抗（数据未显示）。

图4.利用三种RP溶剂体系重复进样(n=6)进行NIST mAb完整分子量分析得到的五种主要糖型（G0F/G0F、G0F/G1F、G1F/G1F、G1F/G2F、G2F/G2F）去卷积谱图的相对MS响应比较。

mAb亚基（scFc、LC和Fd）分析

使用沃特世单克隆抗体亚基标准品和五分钟梯度LC-MS方法进行亚基分析。图5（左）分别显示了IPA、MeOH和ACN用作流动相B的TIC比较。这些色谱图表明亚基（scFC、LC和Fd）在所有流动相条件下均良好分离。图5（右）显示了scFc的组合原始谱图。总体而言，当使用不同的流动相溶剂时，三种亚基的信号质量均未观察到重大差异。如果将使用ACN作为流动相B时三次进样的平均TIC强度视为1.00，可计算出IPA和MeOH作为流动相B时，平均TIC强度分别为1.18和1.06。在原始MS谱图中观察到类似的信号响应比率。该实验结果表明IPA和MeOH对mAb亚基MS响应的性能至少与ACN一样好。 

图5.使用IPA、MeOH和ACN作为流动相溶剂分析Waters NISTmAb IdeS酶解和还原亚基标准品获得的TIC比较（左）。scFc亚基的组合原始谱图比较（右）表明，几种溶剂得到的MS谱图质量相当。

使用UNIFI/waters_connect进行MaxEnt1电荷态去卷积处理后，主要的已鉴定亚基（scFC、LC和Fd）见表2。在实验中，三种亚基获得了相似的质量精度（小于15 ppm）和主要蛋白形态相对丰度。

表2.使用IPA、MeOH和ACN作为LC-MS溶剂分析Waters NISTmAb IdeS酶解和还原亚基标准品获得的质量精度和相对丰度比较。

在本研究中，LC系统压力随不同的溶剂体系发生显著变化。图6是三种有机溶剂的系统压力叠加图。使用IPA时的系统压力(7500 psi)远高于MeOH (3000 psi)和ACN (2500 psi)。系统压力差反映出IPA在单独使用或按梯度与水混合使用时，比其他两种溶剂具有更高的粘度6, 7, 8。本研究使用的流速为0.4 mL/min，色谱柱(2.1 x 50 mm)保持在80 °C，系统压力稳定保持在ACQUITY系统的18k psi限制范围内。然而，作为额外的预防措施，当使用IPA作为有机流动相时，仍应注意系统压力的变化，尤其是在修改了本研究所用流速、色谱柱尺寸或柱温的情况下。

图6.使用IPA、MeOH和ACN作为流动相溶剂分析Waters NISTmAb IdeS酶解和还原亚基标准品获得的系统压力曲线。

结论

本研究探索了异丙醇(IPA)和甲醇(MeOH)作为更安全、更经济的有机流动相溶剂，取代ACN用于生物治疗药物完整分子量分析的应用。实验结果表明，醇类溶剂在完整单克隆抗体数据质量（例如峰形、原始谱图的糖型峰谷百分比）、质量精度和灵敏度方面与ACN具有可比性。当我们在类似的LC-MS实验条件下实施mAb亚基（scFc、LC和Fd）分析时，观察到了相同的结果。基于上述环保和成本优势，沃特世支持科学家们为完整蛋白的LC-MS分析开发更环保、更具成本效益的方法。 

参考资料

  1. Welch, J., et al.Greening Analytical Chromatography, Trends in Analytical Chemistry, Vol.29, No.7, 2010.
  2. Yabré, M., et al.Greening, Reversed-Phase Liquid chromatography Methods Using Alternative Solvents for Pharmaceutical Analysis, Molecules Vol.23, 1065, 2018.
  3. Funari, C., et al.Acetone as a Greener Alternative to Acetonitrile in Liquid Chromatographic Fingerprinting.J Separation Science.Volume 38, Issue 9, Pages: 1441–1624, 2015.
  4. FDA Q3C–Tables and List Guidance for Industry: https://www.fda.gov/media/71737/download.
  5. Dillon, T., et al.US patent: US 2005O161399A1, 2005.
  6. Waters “ACQUITY UPLC TUV Detector, Operator’s Overview and Maintenance Guide”, Waters User manual: 715004733, Page 82, 2014.
  7. Shion, H.; et al.在数据完整性环境下进行可重现的完整分子量例行分析.沃特世应用纪要, 720006472ZH, 2019.
  8. Li, J., et al.Selection of Solvents and Mobile Phases for HPLC to Optimize Sensitivity of UV Detection, Analysis and Purification 2(1): 72–75 (1987).
  9. Li, J., et al. Signal-to-Noise Optimization in HPLC UV detection, LC-GC 10 (11): 856–864 (1992).
  10. Snyder, L. et al.Practical HPLC Method Development, 2nd ed., pp.59-79 and 722–726, 1997. 

致谢

作者在此感谢Scott Berger（沃特世公司生物制药市场团队高级经理）对本应用纪要草稿的宝贵意见和编辑。

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