使用MaxPeak Premier色谱柱提高多种液相色谱系统上金属敏感分析物的回收率

金属吸附是LC分析中的一个严重问题，特别是对于磷酸化肽等高酸性探针或核苷酸等小分子。这些探针会与色谱金属表面相互作用，导致峰形不佳、峰面积减小，甚至导致回收率完全损失¹。 采用MaxPeak高性能表面(HPS)技术可以缓解这个问题，该技术已应用于沃特世LC色谱柱和LC系统。但其他竞争厂商的LC系统尚未采用这项技术。在本文中，我们展示了在三种不同的非沃特世LC系统上使用MaxPeak Premier色谱柱分析金属敏感分析物5'-(α,β-亚甲基)二磷酸腺苷(AMPcP)的结果。该探针的金属敏感性很强，但比三磷酸腺苷或二磷酸腺苷等化合物更稳定²。 我们的研究结果表明，无论使用何种LC系统，MaxPeak Premier色谱柱与不锈钢色谱柱相比都能得到更高的峰面积，从而提高AMPcP的分析物回收率。这表明MaxPeak Premier色谱柱的优势与系统无关，该色谱柱几乎对所有系统配置都能发挥有利作用。

优势

• 使用MaxPeak Premier色谱柱增加AMPcP的峰面积或回收率
• 使用AMPcP/腺苷标准品在不同LC系统上表征金属相互作用的程度
• 金属敏感分析物的回收率与系统无关

LC系统中的金属表面（包括色谱柱硬件）可通过路易斯酸碱作用与酸性分析物相互作用，导致峰形和回收率不佳。碱性或中性化合物也可能通过其他反应机理发生相互作用，但这些相互作用在酸性探针中更常见。金属表面在中性和酸性pH值环境中带正电荷，因此可以使用高pH流动相尽可能减轻这种影响。但即使在高pH条件下，这种影响仍然会导致问题。为解决此问题，沃特世生产的许多色谱柱和一些LC系统（包括ACQUITY Premier系统）采用了MaxPeak高性能表面(HPS)。在ACQUITY Premier系统上使用MaxPeak Premier色谱柱，可以大幅减少金属相互作用，使酸性探针获得高回收率和良好峰形^1,3-5。 虽然MaxPeak Premier色谱柱与ACQUITY Premier系统结合使用时可以发挥最大优势，但这种色谱柱也可用于任何LC系统，以提高酸性探针的回收率。

因此，针对该应用开展的工作表明，与传统的不锈钢色谱柱技术相比，XSelect Premier HSS T3色谱柱可以提高非沃特世LC系统上酸性探针的回收率。使用含等摩尔浓度AMPcP和腺苷的标准品评价Agilent 1290 Infinity I、Shimadzu Nexera-I LC2040和Thermo Vanquish UHPLC系统，以研究三种LC系统的金属相互作用。AMPcP是一种含有两个磷酸基团的化合物，对金属表面敏感，但不会发生水解，因此比核苷酸探针更稳定。腺苷是一种与之结构相似的化合物，但不含磷酸基团，可以测量类似的UV响应，不过没有潜在的金属相互作用。本研究的结果表明，无论使用何种系统，XSelect Premier HSS T3色谱柱的回收率都居于较高水平，在其中一个示例中，该色谱柱的回收率比测试的传统色谱柱高出50%以上。

样品描述

将沃特世AMPcP和腺苷标准品（部件号：186009755）复溶于200 µL Milli-Q水中，然后在进样前将样品瓶涡旋10秒。在每套系统上进行分析之前，利用同一批标准品新制样品。 

AMPcP之前已被用作质量控制标准品，来表征采用和不采用MaxPeak HPS技术的系统上金属相互作用的程度²。结合结构相似但无反应性的化合物（如腺苷），可以比较金属敏感的AMPcP和不敏感的探针的峰面积。本研究所用标准品为等摩尔浓度的腺苷和AMPcP，可以直接比较峰面积并计算峰面积比，以便评估系统中的金属相互作用。因此，我们使用该标准品来评价没有采用HPS技术的其他LC系统，以验证MaxPeak Premier色谱柱的性能优势与系统无关。为此，必须将记录的标准品LC条件转移到被测色谱柱的系统配置中。使用ACQUITY方法转换计算器更改方法，对新色谱柱应用正确的分析条件。开始测试前，将每根色谱柱在起始条件下平衡10分钟，然后执行空白进样。测试的第一套系统是配备四元泵和DAD检测器的Agilent 1290 Infinity I。图1显示了Agilent 1290系统上生成的第一张AMPcP腺苷标准品色谱图。 

与其他两种色谱柱相比，使用XSelect Premier HSS T3色谱柱获得的AMPcP峰明显更高，这一结果的直接原因是色谱柱中的MaxPeak HPS硬件，因为XSelect HSS T3的固定相与之相同，但色谱柱硬件不同。Zorbax SB-Aq色谱柱获得的峰高略高于XSelect HSS T3色谱柱，但仍不及XSelect Premier HSS T3色谱柱。此外，如表1所示，使用XSelect Premier HSS T3色谱柱获得的AMPcP峰面积最大。

XSelect Premier HSS T3色谱柱得到的AMPcP平均峰面积比其他被测色谱柱高50%以上。同时，三种被测色谱柱得到的腺苷峰面积一致。不锈钢色谱柱上的金属相互作用导致分析物损失是AMPcP峰面积降低的直接原因。使用不锈钢硬件的两种色谱柱性能相似，峰面积比分别为0.34和0.35，而XSelect Premier HSS T3色谱柱的峰面积比为0.54，其峰面积比更高，表明每种色谱柱的金属吸附水平不同。峰面积比越高，检测到的吸附越少。 

我们接下来研究了配备四元泵和UV检测器的Shimadzu Nexera-I LC2040系统。在初始测试期间，腺苷的保留性高于预期，需要更改方法。该结果的原因可能是系统的梯度延迟差异以及系统配置不同。在Shimadzu系统上，将流速增加到0.7 mL/min。此外，该系统上腺苷和AMPcP的UV信号较低，因此将进样量增加到3 µL。使两种探针均获得良好UV信号对于测定峰面积比和评估色谱柱的金属相互作用至关重要。图2显示了在Shimadzu Nexera-I上使用三种色谱柱生成的色谱图。

初看这三种色谱柱获得的峰高相似，性能相当，但XSelect Premier色谱柱得到的峰高略高一些，与在Agilent系统上的结果相似。这可能是由于Shimadzu系统上的标准品进样量有所增加，是实现合理峰高所需的进样量。以前的分析结果已经表明，载样量（即进样到色谱柱上的分析物质量）不同，吸附的影响不同^1,3,7。虽然三种色谱柱之间的色谱结果差异很小，但使用XSelect Premier HSS T3色谱柱仍观察到峰面积有所增加。表2显示了在Shimadzu Nexera-I系统上重复进样标准品得到的平均峰面积。

XSelect Premier HSS T3色谱柱得到的平均峰面积比其他两种色谱柱高10%，峰面积比高出近0.2个单位。这表明，虽然三种色谱柱之间的色谱性能相当，但XSelect Premier HSS T3色谱柱在分析物回收率方面仍具有优势。

最后要测试的系统是配备四元泵和UV检测器的Thermo Vanquish系统。使用Chromeleon 7.2进行软件控制。图3显示了在Thermo Vanquish系统上使用三种色谱柱分析AMPcP腺苷标准品得到的色谱图。

在Thermo Vanquish系统上，XSelect Premier HSS T3色谱柱得到的峰面积比其他两种色谱柱高20%。XSelect Premier HSS T3色谱柱得到的峰面积比也比其他两种色谱柱高出近0.2个单位。 

我们选用了三套LC系统来测试三种不同色谱柱的金属相互作用程度。为测试金属的相互作用，我们分析了金属敏感探针(AMPcP)和不敏感探针（腺苷）。将这两种探针一起分析时，可以比较两者的峰面积，获得峰面积比。该比值是衡量金属相互作用在系统中可能的影响程度的指标。峰面积比越高，表明金属相互作用越少。

本研究中获得的峰面积比表明，与不锈钢色谱柱相比，MaxPeak Premier色谱柱可提高酸性探针的峰回收率。无论使用何种LC系统，MaxPeak Premier色谱柱都可以帮助分析人员检测和定量酸性分析物，且无需使用钝化剂或专门的分离方法。使用MaxPeak Premier色谱柱可以使定量更准确，检测限可能更低，而这两点对于某些检测来说至关重要。  

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3. DeLano M, Walter TH, Lauber M, Gilar M, Jung MC, Nguyen J, Boissel C, Patel AV, Bates-Harrison A, Wyndham K. Using Hybrid Organic-Inorganic Surface Technology to Mitigate Analyte Interactions with Metal Surfaces in UHPLC.Analytical Chemistry (2021) 5773–5781.
4. Isaacs G, Plumb R. ACQUITY Premier液相色谱技术显著改善磷酸化和羧化脂质的灵敏度、峰形和回收率.沃特世应用纪要.720007092ZH.
5. Smith K, Rainville P. 使用ACQUITY Premier系统解决方案改善人血浆中三羧酸(TCA)循环分析物定量分析的灵敏度和色谱峰形.沃特世应用纪要.720007107ZH. 
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