评价Waters ACQUITY Premier系统作为一种灵活的液相色谱平台广泛部署于生物制药实验室的能力

由于整个行业对分析实验室的要求不断增加，因此需要以高效的方式利用液相色谱平台来提高生产率。本研究评价了Waters ACQUITY Premier系统与各种液相色谱技术的兼容性，以确定其作为液相色谱平台支持广泛部署于生物制药实验室的适用性。具体而言，评价了离子交换、体积排阻和疏水作用色谱作为既有技术的补充技术，结合MaxPeak高性能表面(HPS)技术实现的性能提升。本研究证明，ACQUITY Premier系统与采用高离子强度流动相的方法兼容，能够以高度可比性可靠运行既有方法，有利于在液相色谱平台之间更轻松地完成方法转换。综上，搭载MaxPeak HPS技术的Waters ACQUITY Premier系统提供了一种灵活的液相色谱平台，可广泛部署于实验室中以支持生物治疗药物开发和生产中的分析需求。  

优势

• ACQUITY Premier系统可兼容高离子强度流动相
• MaxPeak HPS技术可广泛部署于生物制药实验室中
• ACQUITY Premier系统提供了与现有平台相当的性能，有利于轻松完成方法转换

在生物制药产品的开发和生产中，生物分子的表征和监测通常需要采用涵盖多种技术的正交方法。随着对产品线的工作效率要求不断提高，实验室非常需要高效并且能兼容整个组织中所用各种技术的液相色谱平台。沃特世近期推出了采用MaxPeak高性能表面(HPS)技术的ACQUITY Premier系统。MaxPeak HPS技术旨在减少由于分析物/表面相互作用而引起的吸附损失，已证明可有效应用于生物分子的分析中，改善RPLC、HILIC和IP-RPLC等技术对金属敏感分析物的色谱性能^1-3。随着这些技术的性能得到显著提升，ACQUITY Premier系统在更多液相色谱技术中的表现引人关注。更具体地说，生物治疗药物在开发和生产活动中常使用结合高离子强度流动相的方法，例如体积排阻色谱(SEC)、离子交换色谱(IEX)和疏水作用色谱(HIC)。本研究的目的是评价ACQUITY Premier系统作为一种灵活的液相色谱平台广泛部署于实验室的能力，以支持生物治疗药物表征和生产中的分析需求。  

本研究的目的是确定ACQUITY Premier系统是否兼容采用高离子强度流动相的方法，以及MaxPeak HPS技术在这些条件下能否发挥色谱性能提升的额外优势。为此，本研究选择了IEX、SEC和HIC方法作为生物制药行业中常用的代表性方法，此前尚未使用ACQUITY Premier系统评价这些方法。本研究采用常规ACQUITY UPLC系统确定基准性能，以便于在同类ACQUITY Premier系统上使用相同方法时进行比较讨论。

离子交换色谱(IEX)

IEX色谱法是业内用于深入了解生物治疗药物结构和电荷特征的常用技术。该技术可采用盐梯度或pH梯度分离阴离子和/或阳离子电荷异构体，并且具有“弱”和“强”两种形式。IEX的通用性及其作为杂质分析技术的常规用途，使其成为评价ACQUITY Premier系统作为液相色谱平台的灵活性的理想选择，以评价该系统能否在整个组织中广泛部署以支持开发和生产活动。本研究使用西妥昔单抗（一种市售mAb治疗药物）在IEX条件下（使用20 mM HEPES制得的盐梯度）进行分析。分离采用Waters BioResolve SCX mAb色谱柱（部件号：186009058），使用在20 mM HEPES中制备的25–65 mM NaCl的优化梯度，pH 6.7。如图1A所示，从定性角度来看，ACQUITY Premier系统能够以与常规液相色谱系统相同的精度分辨电荷分布。从定量角度进一步检查色谱图发现（如图1B所示），两种系统的分离结果在保留时间(RT)、分离能力（以p/v表示）和峰容量方面无统计学差异。在使用MES缓冲液以及使用Waters IonHance CX-MS pH缓冲液（部件号：176004498）的pH梯度所进行的分离中，也观察到ACQUITY Premier系统表现出相媲美的性能（数据未显示）。这些初步结果表明，ACQUITY Premier系统平台可以提供与常规仪器相当的性能，并为生物制药实验室中部署的液相色谱技术提供更广泛的适用性。

体积排阻色谱(SEC)

SEC技术的独特之处在于它采用等度条件，可基于分析物的大小根据其进出固定相多孔网络的能力实现有效分离。该技术已证明在生物药物分析中非常有利，因为它可以使用“兼容”或非变性流动相，从而深入了解产品/工艺相关杂质（例如聚集体或降解物）。作为一种等度方法，使用SEC分析的分析物从进样到检测都处于持续流动状态，不会吸附到固定相上。这使SEC提高了对吸附现象的灵敏度（该现象可能影响峰形和整体性能），成为确定MaxPeak HPS技术是否比传统液相色谱平台更具优势的理想测试案例。为确定这一点，使用ACQUITY BEH SEC蛋白分析专用柱（部件号：186008471）分析由人源化NIST mAb RM8671和未还原IdeS酶解NIST mAb片段所组成的沃特世mAb大小异构体标准品（部件号：186009429）。分析在业内典型的等度条件(50 mM Na₂HPO₄/200 mM KCl, pH 6.9)下进行，流速0.300 mL/min。如图2A所示，ACQUITY Premier系统与常规液相色谱平台在整体谱图方面具有相当的性能，而在从原型峰分离“片段”物质方面表现出更出色的性能（插图），峰谷(p/v)比提高34%(1.41 vs 1.90)。需要注意的是，观察到的性能提升可能仅限于该标准品，因为高分子量物质(HMWS)与低分子量物质(LMWS)的分离度无统计学差异。总体而言，所得数据仍表明MaxPeak HPS技术在很大程度上与利用常规液相色谱硬件的现有方法兼容，同时在一些情况下可以为生物药物开发和生产中部署的SEC技术带来额外优势。

疏水作用色谱(HIC)

HIC是测定抗体偶联药物(ADC)关键属性的一种常用技术。作为一种非变性方法，HIC可保留半胱氨酸偶联ADC的药物分布特征，从而准确测定药物偶联比(DAR)以评估药物安全性和有效性。该技术需要使用高离子强度梯度，是在严苛条件下评估ACQUITY Premier系统性能的理想测试案例。本研究使用由硫酸铵制备的10 min高离子强度(2 M)梯度，用Waters Protein-Pak Hi Res HIC色谱柱（部件号：186007583）分析ADC特征肽段。如图3A所示，使用ACQUITY Premier系统获得的色谱图与采用常规液相色谱系统所得到的色谱图非常吻合。仔细检查各峰峰面积（如虚线所示），三次重复运行的标准偏差表明，两种系统的分离结果无统计学差异（图3B）。这些结果证明，ACQUITY Premier系统在严苛条件下仍具有良好的重现性，可提供与常规液相色谱系统相当的性能，从而能够更轻松地在不同平台之间进行方法转换。 

本研究通过比较Waters ACQUITY Premier系统与现有平台，评价了该系统与生物制药行业中各种常用技术的兼容性，两种系统在IEX、SEC和HIC应用中表现出高度相似的性能。从定量角度来看，两种液相色谱平台之间的结果在很大程度上无法区分，表明传统方法的转换是可行的。在本研究中，MaxPeak HPS技术并未给采用高离子强度流动相的技术带来特别优势，这一结果在意料之中，因为流动相的离子强度可能会减轻分析物/表面吸附现象。更重要的是，本研究证明，采用MaxPeak HPS技术的Waters ACQUITY Premier系统提供了一种灵活的液相色谱平台，可广泛部署于实验室中以支持生物治疗药物表征、开发和生产中的分析需求。  

1. Birdsall, R. E., Kellett, J., Ippoliti, S., Ranbaduge, N., Shion, H., Yu, Y. Q. 采用MaxPeak HPS技术的ACQUITY Premier可提高RPLC-MS方法分析酸性肽的色谱性能.沃特世应用纪要, 720007003ZH, 2020.
2. Koshel, B. M., Birdsall, R. E., Yu, Y. Q. Improving Recovery and Quantitation of Oligonucleotide Impurities Using ACQUITY Premier with MaxPeak HPS Technology.Waters Application Note 720007238EN 2021.
3. Kellett, J., Birdsall, R.E., Yu, Y.Q. Increasing Recovery of Phosphorylated Peptides Using ACQUITY Premier Technology Featuring MaxPeak High Performance Surfaces.Waters Application Note, 720007198EN 2021.