• 应用纪要

在常规食品分析中检测蜂蜜中的异常组分

在常规食品分析中检测蜂蜜中的异常组分
  • Gitte Barknowitz
  • Sara Stead
  • Waters Corporation
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摘要

本应用纪要使用新型高性能台式正交加速飞行时间(Tof) LC-MS系统，在简化且优化的标准操作模式下结合直观软件和自动化工作流程方法（包括多变量统计），考察非靶向代谢组学能否甄别多花种与单一植物来源的蜂蜜样品并检测蜂蜜保健品中的非法添加剂。

优势

ACQUITY RDa检测器作为一种调查蜂蜜中典型掺假物的工具，在适用的高分辨率LC-MS (Tof)平台上提供了简化的数据采集和处理方法，刚开始涉猎食品真伪分析的新用户也能够轻松使用。

简介

近年来，消费者愈发追求健康、自然的生活方式，这使全球蜂蜜市场日益扩大。蜂蜜中含有抗氧化剂和消炎成分，是食品和饮料工业中天然糖、糖浆和人造甜味剂的替代品，也常被用于伤口辅料、感冒药等药品和消费品中1。

蜂蜜是一种具有高价值的食品，很容易发生各种形式的食品掺假行为。例如，麦卢卡这样的特定单花种蜂蜜产品因掺假行为导致竞争力下降，结果使真正的养蜂人破产，因为他们无法与掺假产品打价格战，从而严重影响当地生态系统和农业发展。蜜蜂的作用涉及到人类三分之一的食物，通过保障生产者经营权益以及打击市售蜂蜜掺假行为保护全球蜜蜂种群，在许多层面上仍然面临持续的挑战2。 此外，含有蜂蜜的天然保健品贴有各种健康和营养标示，但通常会非法添加未经批准的药物活性化合物来增强产品“功效”，可能威胁消费者安全。

食品和饮料制造商依靠其供应链来确保消费者选择正确、产品购买成本适中、产品质量稳定且原料供应持续。随着全球供应系统面临人口增加、有限资源需求不断增长和饮食结构不断变化的压力，企业还需要警惕潜在的食品掺假行为，与客户和供应商积极合作以鉴别并降低食品掺假风险。

蜂蜜分析非常复杂，由于掺假类型多种多样，因此需要使用多种分析技术。利用光谱和质谱技术同时检测多种成分并配合多变量分析(MVA)是一种非常有潜力的蜜源甄别方法3。 LC-HRMS技术被广泛用于食品和饮料行业的代谢分析，其中就包括蜂蜜分析。本研究使用新型高性能台式正交加速飞行时间LC-MS系统，在简化且优化的标准操作模式下结合直观软件和自动化工作流程方法（包括多变量统计），考察非靶向代谢组学能否甄别多花种与单一植物来源的蜂蜜样品并检测蜂蜜保健品中的非法添加剂。

该系统由UNIFI软件控制，可自动完成设置和校准程序，并通过内建的非靶向筛选工作流程处理数据，大幅简化操作流程，如图1所示。

图1.使用ACQUITY RDa检测器进行蜂蜜筛选和调查时，从样品前处理到数据处理的工作流程，仪器设置、数据采集、结果处理、MVA和调查均在同一平台上完成。

实验

分析多花种和单花种来源（麦卢卡）的蜂蜜样品。每种类型各选择三种不同的样品，重复进样三次（每组共包含9个数据点）。还调查了一种蜂蜜保健品。使用质控(QC)混合样品评估分析的技术重现性。

选择一种快速、简单的样品前处理方法，该方法只需大约30 min即可处理包含多达40个样品的批次。首先，量取1 mL蜂蜜加入离心管中，与20 mL萃取溶剂（甲醇/水(30/70%, v/v)，含0.1%甲酸）混合，并以5000 rpm离心5 min，然后将上清液在30 °C下超声处理1 min。随后取1 mL样品萃取物转移至UPLC玻璃样品瓶中，并取5 μL样品进样至与ACQUITY RDa检测器联用的ACQUITY UPLC I-Class PLUS系统中进行分离。工作流程见图1。

该仪器采用内置的SmartMS技术，便于刚接触高分辨率仪器的新用户进行设置。借助ACQUITY RDa系统，设置解决方案可永久地连接至仪器，并且可以在直观的页面上为操作员展示仪器设置。系统自动完成检测器设置、自动调谐和质量数校准，并在准备好采集数据时显示提醒。

使用waters_connect（1.2.0版，沃特世）上的UNIFI结合EZinfo（3.0.3版，Umetrics）进行数据采集和结果处理：采用UNIFI进行峰提取；采用EZinfo进行多变量分析。处理结果前，在UNIFI的样品列表中为“组ID”添加附加列，用于在EZinfo中自动标记标志物。将质量范围和保留时间限制设置为完整范围以便发现标志物，UNIFI生成约40,000种标志物。这些标志物通过自动化程序转移至EZinfo进行多变量分析。将模型缩放设置为Pareto，并将标签更改为“组ID”。生成S-Plot，用于比较实测保健品蜂蜜与质控混合样品。

液相色谱条件

液相色谱系统：

ACQUITY UPLC I-CLASS PLUS

色谱柱：

ACQUITY BEH C18 2.1 × 100 mm, 1.7 µm

流动相A：

10 mM乙酸铵水溶液

流动相B：

乙腈

柱温：

45 °C

进样体积：

5 µL

梯度

时间(min)

流动相B (%)

曲线设置

0.0

1

初始

0.75

1

6

2.0

5

6

3.0

5

6

6.5

55

6

8.5

90

6

9.0

90

6

9.1

1

6

12.0

1

6

质谱条件

质谱检测器：

ACQUITY RDa检测器

模式：

碎裂模式下的全扫描（伪MSE采集）

质量范围：

低(50～2000 m/z)

极性：

正

扫描速率：

10 Hz

锥孔电压：

30 V

碎裂锥孔电压：

60-180 V

毛细管电压：

1.5 kV

脱溶剂气温度：

550 °C

结果与讨论

非靶向分析和MVA

使用10k分辨率的LC-Tof和无监督式MVA (PCA)，可以根据多花种和单花种轻松甄别蜂蜜样品，表现出良好的组内和组间聚集。在整个采集过程中以随机间隔重复进样QC混合样品，评估技术差异。发现QC混合样品进样结果非常紧密地聚集在一起，在PCA得分图中处于多花种和单花种蜂蜜群之间，表明整个系统的技术差异很小，适合进行多变量分析。

图2展示了多花种或单花种来源、蜂蜜保健品和混合QC样品等蜂蜜检测组之间的甄别结果。蜂蜜保健品组与其他组明显不同，在EZinfo中参照QC混合样品对其进行了单独调查。三个多花种和三个麦卢卡蜂蜜样品之间的组内差异也很明显。

图2.所分析的蜂蜜与混合QC样品的Pareto模型。模型由28,000种标志物生成。

标志物解析工具

在生成的S-Plot中，蜂蜜保健品表现出丰富且独特的标记离子（m/z为390.1456）（图3）。

图3.上图为蜂蜜保健品与QC混合样品的S-Plot。下图展示了在目标标志物返回UNIFI并按下启动Chemspider数据库搜索的开始按钮之后所打开的窗口。突出显示的椭圆标记出软件中需要单击的位置。

用母离子质量数进行Chemspider搜索后，初步鉴定出所选标志物为药物化合物他达拉非，并以初始数据采集时所用的伪MSE采集和锥孔电压递增条件进行碎片离子确认。通过单击三次（如图3所示）从EZinfo的S-plot中重新导入目标标志物后，在UNIFI中进行调查。

在图3的左下角，自动生成的标志物汇总图显示在UNIFI中，其中展示了整个样品组中所选标志物的丰度。EN1、EN2和EN3分别表示从产品的三个不同等分试样中获得的蜂蜜保健品进样结果。QC2是包含保健品的QC混合样品，在本文件中称为QC混合样品。

定量分析工具集

在鉴定出标志物后，对他达拉非标准品进行定量分析。在UNIFI中创建谱库条目，从Chemspider下载mol文件并添加至该条目（图5），使UNIFI能够根据结构生成预测的碎片离子，并通过伪MSE数据查找这些碎片离子。然后添加新的他达拉非谱库条目来更新UNIFI中的处理方法，重新处理数据以估计阈值。在UNIFI中应用非线性曲线拟合，结果表明，500~3000 ng/mL范围内的R2为0.994（图4）。估计蜂蜜保健品中他达拉非的计算浓度超出药品希爱力中的剂量上限，给不知情的消费者带来潜在的健康风险。此功能在实施全面定量所需的后续分析之前估算掺假水平非常有用。

图4.他达拉非校准曲线
图5.UNIFI屏幕截图，展示如何添加mol文件以手动修改新建的谱库条目。
图6.样品列表中化合物他达拉非的汇总图，在UNIFI中自动生成。

结论

  • 装配ACQUITY RDa检测器的ACQUITY UPLC I-Class PLUS系统可实现高效分离和全面、无偏的MS采集，提供信息丰富的数据，包括母离子和碎片离子的精确质量数和同位素分布结果，以便在UNIFI代谢组学工作流程中使用。
  • 该系统适用于分析复杂食品基质，例如蜂蜜。能够甄别多花种和单花种蜂蜜的类型，还能够回顾性检测非法添加剂、异常污染物和掺假物。
  • 简单的仪器系统设置和精简的工作流程改善了用户体验，使实验室能够快速获得结果。
  • 本应用纪要使用蜂蜜作为目标基质，但该技术平台和工作流程在食品与饮料检测行业的许多不同应用领域中也表现出应用潜力。

参考资料

  1. Honey Market Size, Share & Trends Analysis Report by Application (Food & Beverages, Personal Care & Cosmetics, Pharmaceutical), by Distribution Channel, by Region, and Segment Forecasts, 2019–2025, Grand View Research, 2020 via https://www.grandviewresearch.com/industry-analysis/honey-market.
  2. Honey Fraud – The Impact on Beekeeping, Poelsma, 2020 via https://www.vatorex.com/blog/bee-culture-3/post/honey-fraud-the-impact-on-beekeeping-17.
  3. 使用非靶向高清质谱代谢组学工作流程甄别不同的单花种蜂蜜, Wallace等人, 2017, 沃特世应用纪要720005963ZH.

特色产品

720007087ZH，2021年1月

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