避免因色谱柱可得性而导致的潜在停机：对液相色谱方法改用替代固定相

拥有运行色谱分析并及时获得结果的能力至关重要，在质量控制环境下或开发关键方法时尤其如此。虽然检测延迟并不少见，但是色谱柱延期交货可能会成为一个严重问题。在COVID-19疫情期间，由于供应链问题，分析人员经常遇到色谱柱订单交付期延长的情况。对于依赖特定色谱柱填料的经验证方法，色谱柱短缺可能导致实验室停机，甚至导致QC及相应的产品发布延迟。

更改方法使用的固定相是一种可能的解决方案，尤其是在色谱柱已停止生产或制造商遇到严重供应链问题的情况下。虽然转换方法固定相的过程很简单，但也需要对色谱柱填料和选择性差异有一些了解。固定相之间的差异可通过选择具有相似基质颗粒和键合相属性的适当色谱柱来说明。本文展示了在一篇同行评审论文中找到的，当出现色谱柱短缺时，将方法的原有固定相Inertsil ODS-SP转换为另一种固定相Waters XSelect HSS T3的工具和过程。转换的方法（抗肿瘤药物泊马度胺的强制降解）发表于2015年。强制降解研究在药物发现实验室中非常重要，因为了解新型化合物的降解方式有利于确保药物安全性，并加强了解化合物与生物系统的相互作用。这些研究也可以用作QC环境中的杂质分析。

优势

• 展示如何更改方法使用的固定相
• 在保持分离性能的同时尽可能减小选择性差异
• 针对色谱柱可得性问题提供替代解决方案

在COVID-19疫情期间，许多产品的全球供应链紧张，若干产品的可得性减少。这些短缺产生了极大影响，特别是在救生药物的质量控制放行检测方面。有些制造商的LC色谱柱供应变得非常困难，导致关键测试积压。有些制造商因为勤于采购及确保供应链稳定，受供应问题的影响较小。如果某个供应商的色谱柱供应变难，此时对关键方法改用更可靠的供应商，可能是一种避免潜在停机的稳妥做法。

换用新固定相可能具有挑战性，因为市面上有许多不同的色谱柱填料，即使名称和功能相似的材料也可能产生截然不同的选择性和结果。虽然经验证方法可能需要特定的色谱柱填料，但是选择合适的替代材料仍然具有挑战性。例如沃特世提供的C₁₈固定相或L1色谱柱，共有八种不同的C₁₈键合固定相可用，其中不包括T3固定相。这八种色谱柱是BEH C₁₈、CSH C₁₈、HSS C₁₈、HSS C₁₈ SB、CORTECS C₁₈、CORTECS C₁₈+、SunFire C₁₈和Atlantis dC₁₈；所有色谱柱可能根据分析条件不同而产生略有不同的结果。该列表不包括市场上其他供应商生产的其他C₁₈固定相¹。 如果某种经验证方法需要L1色谱柱，理论上，上述色谱柱中的任一种都合适。除非可以获得有关填料的其他信息，否则很难从中选出一种。

本文展示了几种可用的固定相选择工具，以对之前开发的方法改用替代固定相，并列举了一些改用示例。本研究选择通过多发性骨髓瘤抗肿瘤治疗药物泊马度胺的强制降解分析方法来展示这些工具²。 与许多药物化合物的强制降解研究一样，准确定量和鉴定降解物对于确保不存在给患者造成重大损害的降解物非常重要。此外，对于某些类型的药物，降解途径对于了解生物功能至关重要。这些分析也可以用于质量控制中的杂质检测。虽然该检测使用的所有色谱柱都容易获取，但并非所有分析都是如此，本文所述的工具将有助于在固定相之间迁移方法。     

样品描述

泊马度胺购自Sigma-Aldrich。使用乙腈:水(30:70, w/w)作为样品稀释剂制备体积为4 mL的0.5 mg/mL溶液。为诱导样品降解，加入100 µL 1 M HCl溶液，将溶液在90 °C下加热30 min。向溶液中加入100 µL 1 M NaOH溶液进行中和。将样品用乙腈:0.1%甲酸(30:70, v/v)稀释至泊马度胺浓度为约0.25 mg/mL。再将样品进样至系统以供分析。 

为有效更改方法使用的固定相，必须了解原材料的具体情况。可根据碳载量、颗粒类型、封端和键合相化学性质等详细信息确保选择适当的替代固定相。一些供应商乐意在公司网站上或通过营销材料分享相关信息，尽管表面积或封端类型等一些信息属于专利信息。分析人员可以利用这些固定相特性寻找替代固定相。然而，由于市面上的色谱柱填料数量众多，如果没有外部帮助，很难找到性能相当的材料。这时可以使用沃特世的色谱柱选择工具或其他工具^{3, 4}。 沃特世色谱柱选择工具为用户提供了一系列沃特世色谱柱，性能与21家不同供应商的选定固定相不分伯仲。在本文提供的示例中，分离最初采用GL Sciences的Inertsil ODS-SP色谱柱。该分离（泊马度胺的酸降解途径）代表一个可从使用替代固定相中获益的分析示例。有多种固定相可用于执行此类分析，由此减少潜在停机。虽然Inertsil ODS-SP色谱柱容易获得，但是在出现运输延迟或色谱柱延期交货等不可预见的情况时，使用替代色谱柱进行检测是明智之举。

沃特世色谱柱选择工具推荐使用XSelect HSS T3色谱柱作为Inertsil ODS-SP色谱柱的等效替代品。两种色谱柱均使用全多孔球形硅胶颗粒，与C₁₈填料键合。两种材料的具体参数见表1。

Inertsil ODS-SP色谱柱与XSelect HSS T3色谱柱之间的显著差异包括颗粒表面积和碳载量百分比。XSelect HSS T3材料的碳载量略高，可能是因为键合相密度较高、颗粒封端不同或所用的基质颗粒不同。遗憾的是，Inertsil ODS-SP材料的制造商并未列出键合相密度，因此无法直接比较。根据分析条件和被测分析物不同，键合相覆盖率可能对分离产生显著影响。对于在反相色谱中检测的极性分析物，键合相覆盖率更高可能导致保留减少，因为极性分析物与固定相疏水表面的相互作用较少，更容易溶于流动相中。但是，对于非极性分析物，键合相覆盖率更高将导致保留增加。表面积差异也可能影响分离：在大多数情况下，表面积更高的材料可提供更高的保留性。通过在执行任何实验之前匹配颗粒特性，分析人员可以合理判定，两种固定相的分离性能应相当。 

泊马度胺降解分析需要采用键合相覆盖率较低的C₁₈固定相。泊马度胺的cLogD值小于0，表明它具有中等极性。降解后得到的化合物也是极性化合物，因此使用键合相覆盖率较低的C₁₈固定相能发挥优势。引用的文章中介绍了泊马度胺的主要降解产物及其形成途径。在大多数情况下，降解产物包括酰胺键断裂形成的羧酸基团以及末端带有胺或酰胺基团的杂环开环。有关降解途径的更多具体信息，请参见原创文章²。 图1显示了泊马度胺酸降解样品的色谱分离结果，这些结果在配备UV检测器的Alliance HPLC系统上使用引用的方法条件在两种色谱柱上获得。

在本研究中，这两种色谱柱对泊马度胺酸降解样品的分离性能相当。虽然XSelect HSS T3色谱柱在这些条件下的保留性稍差，但色谱性能与Inertsil ODS-SP色谱柱相似。两种色谱柱上关键峰对峰1和2的USP分离度仅略有不同，均未实现基线分离。在XSelect HSS T3色谱柱上，组分2的USP分离度比Inertsil ODS-SP色谱柱低约30%。但是，对于组分5，XSelect HSS T3色谱柱获得的USP分离度比Inertsil ODS-SP色谱柱高约26%。这两种色谱柱的其他性能指标相当，特别是泊马度胺的USP塔板数和泊马度胺的峰宽，如表2所示。对于这两种性能指标，两种色谱柱非常相似。 

色谱柱可得性问题可能对样品的及时分析产生灾难性影响。在极端情况下，当色谱柱不可用时，实验室可能在等待订单交货期间被迫暂时关闭或暂停产品放行。虽然这一问题通常可以借助适当预测色谱柱需求来缓解，但仍然可能发生由供应链问题导致的意外延迟。使用替代固定相实施关键分析可防止实验室停机。但是，选择合适固定相的过程可能具有挑战性，通常需要对材料有深入的了解，而这点可能并非始终可行。我们提供有多种工具可以指导分析人员完成这些活动，例如沃特世色谱柱选择工具，它可以建议性能相当的固定相作为方法转换的起点。

最初在Inertsil ODS-SP色谱柱上执行的小分子抗肿瘤药物酸降解分析成功转移至XSelect HSS T3色谱柱，选择性和分离性能仅有轻微变化。本研究选择XSelect HSS T3色谱柱是基于这款色谱柱与Inertsil ODS-SP色谱柱具有相当的固定相特性。本示例表明，只要选择正确材料，即可轻松转换方法使用的固定相。

1. USP L色谱柱列表.https://www.waters.com/webassets/cms/library/docs/usp_col_listings.pdf.2021年7月16日访问.
2. Lu P, Wang L, Song M, Hang TJ.Identification and Characterization of Related Substances in Pomalidomide by Hyphenated LC-MS Techniques.Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. (2015) 159–167.
3. 沃特世色谱柱选择工具网页.https://find.waters.com/ColumnCoach/existingcolumn/column 2021年6月11日访问.
4. HPLC色谱柱.色谱柱比较工具.http://www.hplccolumns.org/database/compare.php 2021年6月11日访问.