一种利用UPLC-QDa分析血清中维生素C的快速简便的临床研究方法

本文介绍了一种使用ACQUITY UPLC H-Class PLUS和单四极杆质谱检测器ACQUITY QDa分析血清中维生素C的临床研究方法。利用三氯乙酸(TCA)进行简单的蛋白沉淀为UPLC-QDa分析维生素C提供了足够高的选择性和分析灵敏度。无论是脂溶性维生素¹还是水溶性维生素，UPLC QDa都适合在临床研究中作为维生素分析系统使用。

优势

• 只需200 µL血清
• 样品前处理过程简单
• 一种准确灵敏的血清维生素C分析方法，总分析时间仅6 min

维生素C又称为L-抗坏血酸，是一种水溶性维生素，属于人体必需营养成分。目前已开发出血液维生素C含量分析的研究方法；通常建议将配备电化学检测器(ECD)或紫外检测器(UV)的HPLC方法作为血浆维生素C分析的优选方法^2,3。 电化学检测以其简单、易于小型化、分析灵敏度高、成本相对较低等固有优势，成为一种颇受欢迎的电活性物质检测方法¹。 但是，ECD和UV检测方法都涉及到复杂的样品前处理和流动相，需要使用专用色谱柱，且分析时间长。QDa检测不仅能够提供出色的分析灵敏度和选择性，还能提供与UPLC兼容的分析速度以及质量数确认信息。

移取200 µL样品（校准品、对照品或未知样品）加入干净的微量离心管中。加入600 µL工作内标（1.67 µg/mL维生素¹³C₆，溶于12% TCA (v/v)中）。盖上试管盖，放入多管涡旋器中以1000 rpm离心5 min，再以11000 rpm离心5 min。取400 µL上清液转移至最大回收样品瓶中进行LC-MS分析。使用搭载Atlantis Premier BEH C₁₈ AX色谱柱（1.7 µm, 2.1 x 100 mm，部件号：186009368）的ACQUITY UPLC H-Class PLUS系统，用95%流动相A (MP A)降至5% MP A的梯度进行洗脱，以达到分离目的。进样时间间隔6 min。

图1显示了经处理的血清中0.5 µg/mL维生素C的色谱图。研究分析灵敏度的结果表明，该方法可以实现血清中0.5 µg/mL维生素C的定量分析（%RSD小于20%，偏差小于15%，S/N大于10）。图2显示了该方法的校准曲线。该方法在0.5 µg/mL~20 µg/mL的范围内呈线性。相关系数(r²)大于0.995，且所有校准品残差均小于15%。 

通过在5天内提取并分析经处理的血清中低浓度到高浓度的5个重复样品(n = 25)，评估方法精密度。所有检测浓度水平下的重复性和总精密度均≤6% CV，结果汇总于表1中。测试样品与对照样品相比，检测的典型内源性干扰物质的所有百分比回收率计算值均在±15%以内。

使用内标进行补偿后，来自六个供体的测试样品与对照样品之间的基质因子结果在±15%范围内（表2）。观察到维生素C受到基质造成的显著信号增强影响，但加入内标后得到补偿（调整后的基质因子接近1）。

我们探索了UPLC单四极杆质谱系统（ACQUITY QDa质谱检测器）在涵盖脂溶性维生素至水溶性维生素的临床研究中的应用。样品前处理过程简单，运行时间短，与传统的HPLC方法相比具有显著优势。结果很好地证明了UPLC-QDa适合在临床研究中作为维生素分析系统使用。

1. 在临床研究中利用UPLC-QDa分析血清中的维生素A和E. 沃特世公司, 2021 https://www.waters.com/webassets/cms/library/docs/720007164en.pdf.
2. Gazdik, Z.; Zitka, O.; Petrlova J.; Adam, V.; Zehnalek, J.; Horna, A.; Reznicek V.; Beklova, M.; Kizek, R. Determination of Vitamin C (Ascorbic Acid) Using High Performance Liquid Chromatography Coupled with Electrochemical Detection.Senors, 2008,8, 7097–7112.
3. Robitaille, L; Hoffer, L, J. A Simple Method for Plasma Total Vitamin C Analysis Suitable for Routine Clinical Laboratory Use.Nutrition Journal, 2016, 15:40.