碰撞截面CCS预测工具性能考察与评估

本应用简报介绍碰撞截面预测工具CCSondemand在预测数百种农药化合物CCS值方面的性能。

优势

• SYNAPT HDMS，离子淌度分离-高分辨串联质谱联用技术，四维数据开启并引领定性分析新时代
• 沃特世碰撞截面预测工具CCSondemand，使用灵活简便，预测准确性高，对化合物定性分析具有较高的参考价值和指导意义
• HDMS^E高清全信息串联质谱数据采集，在MS^E不遗漏小峰、窄峰，确保信息全采集的基础上，增加淌度分离，改善图谱质量，并显著提高分析容量

离子淌度-质谱(IM-MS)，是离子淌度分离(IMS)与质谱分析(MS)相融合的一种新型二维检测技术，经过数十年的发展，日臻成熟，正在迅速成为现代分析化学前沿的技术领域之一。碰撞截面(Collision Cross-Section, CCS)，作为IM-MS技术区分不同化合物的重要参数，不依赖于仪器设备和一般实验条件的不同而保持恒定，在化合物的定性分析中显示出独特的优势，但是CCS标准参考值的缺乏，已经成为离子淌度-质谱技术得以广泛应用的瓶颈问题。

因此，行业里涌现出基于化合物结构和离子淌度分离原理的多种CCS值预测工具，多以机器学习类工具为主，即以大量的CCS实验值结合相关化合物离子的结构属性和理化性质，训练机器，在化合物结构、理化性质与CCS值之间建立关联，并以此预测给定化合物结构的CCS值。

本文使用沃特世研发的碰撞截面预测工具CCSondemand，针对数百种农药化合物进行了CCS值的预测，通过与多次实验测定的CCS平均值进行对比，对CCSondemand的预测准确性进行了评价；同时，使用一种公共CCS值预测工具，对相同的化合物组进行CCS值的预测，并就两种预测工具获得的CCS预测值的准确性进行了整体的性能考察与比较。结果显示，沃特世碰撞截面预测工具CCSondemand不仅使用上更加灵活方便，且CCS预测的准确性也更高，充分说明，作为IM-MS技术的主要开拓者之一，沃特世以其雄厚、持久、全面的科技创新能力，始终是该前沿分析领域的技术领跑者。

测试样品与总体实验设计

使用20种农药化合物的混标溶液(P/N: 186006348)，用50%乙腈稀释到适宜浓度，作为质控样品，用于实际样品数据采集前，监控并微调保留时间；含数百种农药化合物的混合溶液作为实际测试样品，下文称为“大混标样品”。获得的数据使用UNIFI科学信息管理系统的筛查工作流程进行分析。筛查分析方法中，使用自建的高分辨串联质谱数据库，库中包含农药化合物数目，正离子模式500+种，负离子模式100+种。用于定性筛查的化合物属性有：化合物母离子/碎片离子的精确质量数、保留时间、结构式，以及理论碎片离子（UNIFI根据化合物结构自动生成）等。

所有测试皆呈阳性检出的化合物，计算其多次进样获得的CCS值的平均值和相对标准偏差(RSD)，并以RSD小于1%的化合物的CCS的平均值，用作评价CCS预测工具预测CCS准确性的参考标准。

CCS值预测工具的选择

• 公共CCS预测工具的选择

许多关注淌度-质谱技术的前沿课题组都在致力于CCS值预测工具的研发，现阶段，不止一种的CCS值预测工具已在网上发布。不同的工具，在进行CCS值预测时，对于待预测化合物信息的输入，有不同的需要，有的工具，针对一个化合物，需要输入多种信息才能进行预测；有的工具对应的网站较难打开，或不对公众开放…。本文找到了一个CCS值的公共预测工具（名称隐去，下文中称作“公共CCS预测工具”）。该预测工具基于大量漂移管和行波离子淌度技术获得的CCS值进行深度机器学习，并结合淌度分离原理研制而成。使用化合物的线性结构SMILE格式，作为单一输入信息，可以给出[M+H]⁺、[M+Na]⁺、[M+NH₄]⁺、[M-H]^-等多种离子加合形式的CCS预测值。

• 沃特世CCS预测工具CCSondemand

沃特世公司研发的CCS预测工具CCSondemand，同样采用深度机器学习的原理，基于多台仪器设备（Vion和SYNAPT）获得的大量化合物不同加合离子的CCS值，结合化合物结构的多种基本属性和理化性质，并依据淌度分离原理研发而成。使用时，只需输入单一化合物结构信息，兼容mol、sdf、inchi、SMILE等多种化学结构格式，可以给出[M+H]⁺、[M+Na]⁺、[M+K]⁺、[M-H]^-、[M+HCOO]^-五种离子加合形式的CCS预测值。因需要的化合物结构信息有多种格式可以选择，容易获得，使用更灵活方便。图1展示了CCSondemand简洁、清楚的应用界面。

农药大混标样品HDMS^E数据的获得

针对大混标样品（含数百种小分子农药化合物）进行多次数据采集，进样信息如表1（正离子模式）、表2（负离子模式）所示，可以看出，样品检测的进样次数，虽受实验目的、仪器使用期限、紧急事件插入等因素的影响而有所不同，但实验条件的差异性跨度皆很大。 

大混标样品HDMSE数据分析与汇总结果

对于正离子模式，用自建数据库中500+化合物对样品数据进行筛查分析，16次筛查结果皆为阳性检出的化合物有339种；对于负离子模式，库中化合物数目100+，8次进样筛查结果皆为阳性检出的化合物数目为92种。查看原始数据，有31个化合物，某几次进样的数据，由于信号过载，导致淌度峰分叉，使软件认错漂移时间，使测得的CCS值错误。剔除这样的CCS值，剔除数目1-6不等。剔除错误CCS值后，所有化合物CCS测定值的相对标准偏差(RSD)皆小于1%，其修正后的RSD分布图见图2。

众所周知，标准偏差对组内测量值中的特大或特小误差反映非常敏感，可用于衡量组内测试值的不确定性和离散程度。鉴于实验设计的多样性，如果多次测定的CCS值，其相对标准偏差(RSD)较小(<1%)，则多次实验获得的CCS的平均值，应该比较接近真值。基于这个假设，在后续的CCS预测准确性评估分析中，以RSD<1%的所有化合物（正离子模式339种，负离子模式92种）CCS测定值的平均值作为参考标准，下文中称为“CCS的实验基准值”。

两种CCS预测工具性能评价与分析

• 正离子模式CCS预测值准确性评价

针对正离子模式339个化合物，使用沃特世CCS预测工具CCSondemand和公共CCS预测工具，分别预测其[M+H]⁺离子的CCS值，并将CCS的预测值与实验基准值对比，计算相对偏离度，计算公式：(理论预测值-实验基准值)/ 实验基准值x100。表3列出了两种预测工具预测获得的CCS相对偏离度的标准偏差(SD)和与之相对应的概率水平，其正态分布曲线如图3所示。根据正态分布原理，参与正态分布分析的数值在平均值(mean)±1倍标准偏差(1xSD)以内的概率水平为68%，即数组内，68%的数值在mean±1xSD以内，依此类推，95%的数值在mean±2xSD以内，99.7%的数值在mean±3xSD以内。

结合表3的数据和图3所示的正态分布曲线可知：1)在正离子电离模式下，两种预测工具预测获得的多数CCS值皆具有较高的准确性，可以对化合物的定性分析起到一定的参考与指导作用；2)对于公共CCS预测工具，99.7%的化合物，其预测获得的CCS值相对于实验基准值的相对偏离度在±10%以内，而对于CCSondemand，99.7%的化合物，其相对偏离度在±5%以内，也就是说，沃特世预测工具CCSondemand对CCS的预测与实验值相比误差相对更小，其预测准确度明显优于公共CCS预测工具。图4为相对偏离度的分布图，也可以很直观的看出这一点。

此外，将339个化合物的CCS预测值和实验基准值进行线性回归分析，回归曲线与线性相关系数见图5，纵轴为CCS预测值，横轴为CCS实验基准值。图中数据点的分布和线性回归系数的大小进一步说明，使用CCSondemand预测工具获得的CCS值与实验基准值吻合度更高。

图中标识的两个化合物Chlorsulfuron（绿色圆点）和Hydramethylnon（紫色圆点）在正负电离模式下皆阳性检出，其CCS测定值与部分数据图谱，见下文的“化合物数据分析举例”部分。

• 负离子模式CCS预测值的准确性评价

同样，针对负离子模式的92个化合物，将CCS预测值和实验基准值及其预测相对偏离度进行了整体分析。图6为负离子电离模式CCS预测值和实验基准值的线性回归曲线。与正离子模式得出的结论一致，CCSondemand给出的CCS预测值与相应的实验基准值吻合度更高。

化合物数据分析举例

• Chlorsulfuron

平行打开同一批次，正、负离子模式下的UNIFI分析结果[以表1中n=16、表2中n=8两次分析为例]，分别找到化合物Chlorsulfuron（图5和图6中的绿色圆点），察看可知其定性鉴定因子的匹配状况良好。图中展示数据皆使用XSelect HSS T3色谱柱，在SYNAPT G2-Si上分辨率模式采集获得，采样时间：2020.6.19。图7为化合物Chlorsulfuron在正、负离子模式下的色谱图（左）和到达时间分布(ATD)谱图（右）。由于使用相同的色谱柱和色谱分离方法，其正离子模式、负离子模式下该化合物的色谱行为完全相同，表现为在两种电离模式下，不仅保留时间相等，色谱峰形也相同，进一步证明了该化合物的阳性检出；其淌度行为中漂移时间因不同电离模式下校正文件的不同而不同，由其计算出的CCS值，也会因离子加合形式不同而有所差别。

表4为Chlorsulfuron多次进样测得的CCS值列表，左边为正离子模式，右边为负离子模式。蓝色标注的为多次CCS测定值的平均值，即上文提到的实验基准值。

• Hydramethylnon

化合物Hydramethylnon（图5和图6中的紫色圆点）的色谱图、淌度分离谱图和CCS测定值列表分别见图8和表5，数据来源与Chlorsulfuron相同。图8中，正离子模式的ATD谱图呈现双峰，通过进一步查看淌度分离热图，基本可以确定，该双峰由同分异构现象所致。淌度分离中的同分异构现象，多源自离子的异构化，即化合物形成离子时，由于电荷加持的位置不同，或者由于电荷的加持，导致电子云重排、结构共振等原因形成。

另一方面，该化合物正、负电离模式ATD峰宽差别较大，正离子模式下ATD峰明显展宽。通过查看淌度分离热图（数据未显示）可以确定，该展宽主要是由于信号较强，导致的淌度峰的拖尾和展宽，这一点也可以从ATD谱图纵轴的强度值得到旁证。

• CCS值的预测与预测偏离度

利用化合物的二维结构(mol文件)和线性结构(SMILE格式)，分别使用CCSondemand和公共CCS预测工具进行CCS值的预测，获得该两个化合物M+H、M-H离子的CCS预测值，如表6所示。表格中预测偏离度的计算公式：(CCS预测值-CCS实验基准值)/CCS实验基准值x100。

由表6中数据可以看出：

• 本文考察的两种CCS预测工具，虽然皆基于机器学习原理，但是由于其用于机器学习的数据源(dataset)、数据量不尽相同，机器学习过程中的运算法则也不尽相同，所以获得的CCS预测值有所不同；
• CCSondemand对这两种化合物的CCS预测的准确度都比较好，预测偏离度皆在2%以内，而公共预测工具对化合物Chlorsulfuron的预测准确度较高，但对化合物Hydramethylnon的[M+H]、[M-H]离子CCS值的预测偏离度却很大。如果使用化合物Hydramethylnon正离子电离模式下，由离子同分异构现象产生的另一个峰（ATD图谱前面一个峰）的CCS值进行计算，其预测偏离度约为 -9.1%，仍然很大，推测原因，可能由于公共预测工具用于机器学习的数据源没能覆盖Hydramethylnon的结构属性与理化性质的特点，或针对该类型结构化合物的数据源本身有问题等等所致，有待进一步研究探索。

可见，两种CCS值预测工具，预测获得的多数CCS值具有较高的准确性，对化合物的定性分析能起到一定的参考与指导作用，但是仍然有部分化合物，CCS预测的准确性有待进一步提高，预测工具的整体性能也需要不断的改进与完善。

沃特世公司的淌度-质谱联用技术，始终走在行业的前列，2007年第一代的淌度-质谱联用仪SYNAPT HDMS就已经作为商品在分析行业现身，经过十几年持续不懈的努力，沃特世的淌度-质谱联用技术已经有了三个独立的产品系列，并在CCS值预测工具的研发方面也取得了显著的研究成果。

本文以数百种农药化合物为测试样品，在实验条件差异性很大的情况下，以多次进样分析获得的CCS的平均值作为参考标准，对沃特世公司自主研发的CCS预测工具CCSondemnad预测CCS值的准确性进行了整体评估，并与目前行业里一种公共CCS预测工具的预测结果进行对比。结果显示，CCSondemand的CCS值预测准确性明显优于公共CCS预测工具，其易用性和预测准确性等皆走在该技术领域的前列。

诚然，对化合物CCS值的预测，还有较长的路要走，其预测准确度也有待进一步提高，相信随着科学家们对离子淌度原理认识的不断深入，大数据分析技术的不断创新与改进，数据运算手段的不断更新换代等等，CCS的预测技术会越来越成熟，其预测的准确性和可靠性也会逐步提高，最终成为分析化学工作者得力的定性分析工具。