• 应用纪要

剖析新型冠状病毒病(COVID-19)：使用环形离子淌度分离技术对O-联糖肽的糖基组成进行结构表征

剖析新型冠状病毒病(COVID-19)：使用环形离子淌度分离技术对O-联糖肽的糖基组成进行结构表征
  • Lindsay Morrison
  • Miloslav Sanda
  • Waters Corporation
  • 乔治城大学医学中心，伦巴第综合癌症中心
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仅供研究使用，不适用于诊断。

摘要

高度糖基化的SARS-CoV-2刺突蛋白与COVID-19的传染性有关，因此，研究人员在表征衣壳刺突蛋白的糖基化模式上开展大量工作，以便为疫苗和免疫药物的开发提供指导。本研究利用新型SELECT SERIES Cyclic IMS的新颖配置，对在刺突蛋白的弗林蛋白酶切位点附近发现的O-联糖肽进行糖基结构和键表征；弗林蛋白酶切会使刺突蛋白的融合序列暴露，导致S1亚基与S2亚基分离，这一过程是病毒进入细胞的必要条件。另外，还鉴定出同时具有α2-3和α2-6唾液酸键的扩展核心1和核心2型结构；研究表明，糖基化会改变底物识别机制，核心2和扩展核心1结构的比率可能影响新型冠状病毒的毒力。

优势

SELECT SERIES Cyclic IMS的新颖设计能够对SARS-CoV-2刺突蛋白中低水平O-联糖肽的糖基结构进行位点特异性、键特异性表征。利用捕集阱碎裂模式从O-糖区域释放出氧鎓离子碎片，并用高分辨率离子淌度技术分离和分析碎片离子。 

 

简介

近期爆发的COVID-19大流行疫情由SARS-CoV-2冠状病毒引起，已导致数百万人患病，迄今为止已经造成全球200万人死亡1。由于是一种新病毒，科学界一直致力于快速表征和编译其生物物理特征，希望能够帮助开发有效的疫苗和免疫药物。SARS-CoV-2病毒颗粒通过用突起的跨膜刺突蛋白与宿主细胞ACE2（血管紧张素转化酶2）受体结合而进入细胞2。 SARS-CoV-2冠状病毒刺突蛋白为同源三聚体I类融合蛋白，由两个高度糖基化的亚基S1和S2组成3,4。 之前对已知病毒病原体（包括流感）的研究表明，外壳的糖基成分在免疫逃逸中发挥至关重要的作用，特别是通过免疫识别位点的空间位阻起作用5-7。

SARS-CoV-2病原体的表征工作包括对冠状病毒刺突蛋白糖基化的多项综合研究。迄今为止，这些研究已经表明，在22个可用的N-糖基化位点中有14个共有占用位点，其余7个位点的占用则存在冲突8-16。 此外，Shajahan等人的研究证明，S1结构域上有三个O-联糖基化位点，其中一个已由Sanda等人确证10,11。在SARS-CoV-刺突蛋白的序列分析中，Andersen和同事预测了S1和S2亚基侧翼连接区中的弗林蛋白酶切位点，该位点对蛋白质激活至关重要2。他们进一步预测，这个含有弗林蛋白酶切位点的区域包含至多三个额外的O-联糖基化位点，推测这些位点的功能与传染性和传播性有关2。 众所周知，O-糖的表征非常困难，原因有：缺乏共有序列、糖型之间的异质性高、相对丰度低。因此，表征这类分析物需要采用高性能色谱与高分辨率、高灵敏度质谱。先前使用沃特世SYNAPT平台进行的研究表明，该平台能够解析游离寡糖异构体的支链和线性糖基结构，并从游离寡糖标准品中分离出α2-3和α2-6键合异构体12-16。SELECT SERIES Cyclic IMS的MS/MS碎裂为多元弗林蛋白酶切位点之前沿连接区的O-联糖基化提供了清晰的证据，并利用环形离子淌度技术对O-糖结构进行位点特异性分离和表征。此项独特实验提供的可扩展分辨率表明存在核心1、扩展核心1和核心2结构混合物，为NeuAcα2-3Galβ1-3GalNAc和NeuAcα2-6Galβ1-4GlcNAc提供了分辨率，这两种异构体具有非常相似的碰撞截面。

实验

样品描述

重组SARS-CoV-2刺突蛋白在HEK 293细胞中表达，购自Acrobiosystems。用DTT还原刺突蛋白中的二硫键，并用碘乙酰胺进行处理，使半胱氨酸残基烷基化，然后用PNGaseF和胰蛋白酶进行酶解。

方法条件

表1、2和3列出了色谱和质谱分析的一般条件。使用五圈环形装置的Cyclic IMS方法之前已经用源自血红素结合蛋白的O-联糖肽针对三糖和二糖碎片进行了优化。源自SARS-CoV-2刺突蛋白的O-糖肽经四极杆分离，然后在SELECT SERIES Cyclic IMS的捕集区中发生碰撞活化（如图1所示）。使用环形离子淌度池分离糖肽的碎片。进行方法优化，使三糖碎片在喷射和检测之前通过装置五次。

SELECT SERIES Cyclic IMS的仪器示意图
图1.SELECT SERIES Cyclic IMS的仪器示意图 

LC条件

液相色谱系统：

ACQUITY UPLC M-Class

检测：

SELECT SERIES Cyclic IMS

样品瓶：

QuanRecovery

色谱柱：

nanoEase M/Z HSS T3 100 Å, 1.8 µm (75 µm × 15 cm)（部件号：186008816）

nanoEase M/Z Symmetry C18 100 Å, 5 µm (180 µm × 20 mm)捕集阱（部件号：186008821）

柱温：

60 °C

样品温度：

8 °C

进样体积：

1–5 μL

流速：

500 nL/min

流动相A：

H2O，0.1% FA，1 ppm柠檬酸

流动相B：

ACN，0.1% FA，1 ppm柠檬酸

梯度

MS条件

MS系统：

Cyclic IMS

电离模式：

ESI+

采集范围：

m/z 50～2000

毛细管电压：

2.8 kV

碰撞能量：

30 V–70 V

锥孔电压：

20 V

圈数：

5

Racetrack TW高度：

22 V

Racetrack TW速度：

375 m/s

IMS顺序：

进样、分离、喷射和采集

IMS运行周期：

100 ms

数据管理

色谱软件：

MassLynx SCN1016 Release 3

MS软件：

用于Cyclic IMS Release 4的沃特世嵌入式分析仪平台

信息学软件：

DriftScope 2.9，针对Cyclic IMS进行了改进

结果与讨论

对观察到的胰蛋白酶解肽AGC(carbamidomethyl)LIGAEHVDNSYEC(carbamidomethyl)DIPIGAGIC(carbamidomethyl)ASYQTQTNSPR（标记为T56）的O-联糖型进行靶向离子淌度MS/MS实验，在捕集区中进行碎裂，生成肽段和氧鎓离子碎片，然后进入离子淌度池。通过碰撞活化释放后，利用环形离子淌度(cIM)仪器的可扩展分辨率分离糖基异构体。之前针对三糖碎片1次和5次通过循环装置开发出两种方法，利用这两种方法分离T56-HexNAc(1)-Hex(1)-NeuAc(1)、T56-HexNAc(1)-Hex(1)-NeuAc(2)、T56-HexNAc(2)-Hex(1)-NeuAc(1)、T56-HexNAc(2)-Hex(2)-NeuAc(1)和T56-HexNAc(2)-Hex(2)-NeuAc(2)的HexNAc-Hex和HexNAc-Hex-NeuAc氧鎓离子碎片的同分异构体。这些肽在表1中以糖肽A-D列出。

利用LC-MS-IM-MS研究的O-糖肽以及实测漂移时间
表1.利用LC-MS-IM-MS研究的O-糖肽以及m/z 657 Neu-Ac-Hex-HexNAc氧鎓离子实测到达时间分布的漂移时间 

利用DriftScope 2.9对产生三电荷未修饰T56肽段碎片的色谱峰进行积分，提取离子淌度信息。一般来说，每种糖型可观察到2~4个色谱峰，表明某些具有异质性的异构体可通过反相色谱法分离。T56糖肽的碰撞诱导碎裂通常会产生肽段、氧鎓与肽+糖基碎片的混合物。图2展示了A)糖肽A和B)糖肽C的MS/MS谱图，证明较大的氧鎓离子碎片具有高产率，对于糖肽C而言尤其如此。m/z 1022处HexNAc(2)-Hex(2)-NeuAc(1)氧鎓离子碎片的观察结果确认存在单个五糖糖型，而不是单独的三糖和二糖成分各自位于两个不同位点。m/z 528和819处的氧鎓离子确认存在扩展核心1结构。

MS/MS放大谱图
图2.m/z 250与m/z 1050范围内A) T56-HexNAc(1)-Hex(1)-NeuAc(2)（糖肽A）和B) T56-HexNAc(2)-Hex(2)-NeuAc(1)（糖肽C）的MS/MS放大谱图，突出显示若干个观察到的氧鎓离子碎片，确认糖肽C中同时存在扩展核心1和核心2结构。如果不明确糖的种类（GalNAc或GlcNAc），则用灰色正方形阴影表示HexNAc残基；所有其他颜色均对应于SNFG表示法（糖基的符号命名法）。 

对HexNAc-Hex-NeuAc氧鎓离子实施单圈和多圈（5圈）离子淌度实验。使用变化的碰撞能量分析糖肽C所得的到达时间分布如图3 (B-D)所示。使用单圈环形离子淌度时，可明显看到两个离子淌度群；使用五圈离子淌度时，更紧凑的物质进一步分离为两种部分分离的异构体。使用Major Mix IMS校准标样作为参比，计算单圈得到的碰撞截面。单圈实验观察到的两个到达时间分布计算出的碰撞截面分别为234.1和245.4 Å2。Guttman等人12之前测得NeuAcα2-6Galβ1-4GlcNAc和NeuAcα2-3Galβ1-4GlcNAc的CCS值分别为236.9 Å2和247.2 Å2。测得的最细长的HexNAc-Hex-NeuAc异构体与NeuAcα2-3Galβ1-4GlcNAc高度吻合。使用五圈环形离子淌度装置时，在234.1 Å2处观察到的单个离子淌度峰分离为两种子结构。先前的研究表明，α2–6唾液酸键比α2–3键更稳定；因此使用变化的碰撞能量进行实验，结果见图3 (B–D)17。对于通过5圈方法可分离的三种最紧凑的异构体，提高碰撞能量能够增加相对丰度。核心1型结构(NeuAcα2-3Galβ1-3GalNAc)是最常见的O-联糖肽结构；因此，5圈分离中更细长且更不稳定的紧凑异构体与NeuAcα2-3Galβ1-3GalNAc 1型核心结构一致。更紧凑且更不稳定的结构可分配给NeuAcα2-6Galβ1-4GlcNAc，其符合核心2结构的预期碎裂结果。

到达时间分布
图3.使用A)单圈环形装置和B–D)五圈环形装置分析糖肽C的m/z 657氧鎓离子所得的到达时间分布，实验在捕集阱中采用70 V、50 V和30 V活化，以生成氧鎓离子碎片。额外的四圈是区分NeuAcα2-6Galβ1-4GlcNAc和NeuAcα2-3Galβ1-3GalNAc异构体碎片的必要条件。 

利用五圈环形离子淌度技术分析剩余糖肽中的m/z 657 (HexNAc-Hex-NeuAc)氧鎓离子，结果见图4。拥有两个HexNAc残基（C和D）的糖肽得到类似的离子淌度到达时间分布(ATD)，表明存在扩展核心1和核心2结构的混合物，如图3所示。最简单的糖肽具有单个HexNAc、Hex和NeuAc残基(A)，在73.8 ms处形成单个离子淌度分布，将其分配给T56-HexNAc(2)-Hex(2)-NeuAc(1)糖肽的NeuAcα2-3Galβ1-3GalNAc，符合已知的糖生物学信息。相比之下，从T56-HexNAc(1)-Hex(1)-NeuAc(2)糖肽中分离出的m/z 657氧鎓离子在68.7 ms和70.4 ms处产生两个额外的离子淌度峰。这些可能是支化结构，在这些结构中，NeuAc残基通过2-3或2-6键与GalNAc连接。在糖肽D中未观察到这些峰，表明核心GalNAc残基（图4B）的唾液酸化对于T56糖肽而言较为罕见，仅存在于简单的核心1结构中。

m/z 657氧鎓离子的到达时间分布
图4.A)糖肽A、B)糖肽B、C)糖肽C和D)糖肽D中m/z 657氧鎓离子的到达时间分布

结论

本研究证明SELECT SERIES Cyclic IMS能够分离SARS-CoV-2刺突蛋白O-糖肽的氧鎓离子碎片，提供有关糖肽中糖结构的位点特异性和键特异性信息。Cyclic IMS仪器拥有高灵敏度、可扩展的离子淌度分辨率和独特的几何结构，可用于低含量O-糖肽的靶向CID-cIM-MS实验，实现高异质性蛋白质的位点特异性结构表征。该策略能够为正在全球开展的SARS-CoV-2病毒表征、理解和靶向作用研究提供更多详细信息。 

参考资料

  1. Johns Hopkins Resource Center.COVID-19 Case Tracker.https://gisanddata.maps.arcgis.com/apps/opsdashboard/index.html#/bda7594740fd40299423467b48e9ecf6.
  2. Andersen K.G., Rambaut A., Lipkin W.I. et al.The proximal origin of SARS-CoV-2.Nat Med 2020; 26:450–452.
  3. Tortorici AM, Veesler D. Chapter Four–Structural insights into coronavirus entry, Editor(s): Félix A. Rey, Advances in Virus Research, Academic Press, 2019, 105:93-116, ISSN 0065-3527, ISBN 9780128184561.
  4. Walls, AC., Park YJ, Tortorici A, Wall A, McGuire AT, Veesler D. Structure, Function, and Antigenicity of the SARS-CoV-2 Spike Glycoprotein, Cell, 2020;181(2):281-292.e6, ISSN 0092–8674.
  5. Clark GF.The Role of Glycans in Immune Evasion: The Human Fetoembryonic Defence System Hypothesis revisited, Molecular Human Reproduction.2014 Mar; 20(3):185–199. 
  6. Chang D, Zaia J. Why Glycosylation Matters in Building a Better Flu Vaccine.Molecular & Cellular Proteomics 2019 Dec; 18 (12):2348–2358.
  7. Khatri K, Klein JA, White MR, Grant OC, Leymarie N, Woods RJ, Hartshorn KL, Zaia J. Integrated Omics and Computational Glycobiology Reveal Structural Basis for Influenza A Virus Glycan Microheterogeneity and Host Interactions.Molecular & Cellular Proteomics 2016 Jun; 15 (6):1895–1912.
  8. Kumar S, Maurya VK, Prasad AK, Bhatt MLB, Saxena SK.Structural, Glycosylation and Antigenic Variation between 2019 Novel Coronavirus (2019-nCoV) and SARS Coronavirus (SARS-CoV).Virusdisease.2020;31(1):13–21. 
  9. Watanabe Y, Allen JD, Wrapp D, McLellan JS, Crispin M. Site-Specific Glycan Analysis of the SARS-CoV-2 Spike.Science.2020;eabb9983.
  10. Shajahan A, Supekar NT, Gleinich AS, Azadi P. Deducing the N- and O- Glycosylation Profile of the Spike Protein of Novel Coronavirus SARS-CoV-2.Glycobiology.2020; cwaa042. https://doi.org/10.1093/glycob/cwaa042.
  11. Sanda M, Morrison L, and Goldman R. N- and O-Glycosylation of the SARS-CoV-2 Spike Protein. Anal. Chem. 2021.
  12. Guttman M and Lee KK. Site-Specific Mapping of Sialic Acid Linkage Isomers by Ion Mobility Spectrometry. Anal. Chem. 2016; 88(10):5212–5217.
  13. Jin C, Harvey DJ, Struwe WB, and Karlsson NG. Separation of Isomeric O-Glycans by Ion Mobility and Liquid Chromatography-Mass Spectrometry. Anal. Chem. 2019. 91(16): 10604–10613.
  14. Harvey DJ, Seabright GE, Vasiljevic S, Crispin M, and Struwe WB. Isomer Information from Ion Mobility Separation of High-Mannos Glycan Fragments. J. Am. Soc. Mass. Spectrom. 2018; 29(5): 972–988.
  15. Barroso A, Giménez A, Konijnenberg A, Sancho J, Sanz-Nebot V, Sobott F. Evaluation of Ion Mobility for the Separation of Glycoconjugate Isomers Due to Different Types of Sialic Acid Linkage, at the Intact Glycoprotein, Glycopeptide and Glycan Level. J. Proteom. 2018. 173:22–31.
  16. Hofmann J, Hahm HS, Seeberger PH, and Pagel K. Identification of Carbohydrate Anomers using Ion Mobility-Mass Spectrometry. Nature. 2015. 526:241-244.
  17. Depland AD, Renois-Predelus G, Schindler B, Compagnon I. Identification of Sialic Acid Linkage Isomers in Glycans using Coupled InfraRed Multiple Photon Dissociation (IRMPD) Spectroscopy and Mass Spectrometry. Int.J. Mass Spectrom.2018; 434:64–69.

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