自动化蛋白质治疗药物混合型LC-MS/MS生物分析的样品制备工作流程：使用亲和纯化和酶解法对依那西普进行定量分析

本应用纪要旨在介绍开发混合型LC-MS/MS成功自动化定量融合蛋白依那西普所用的捕获和酶解方法的过程。

在定量分析之前，采用分步法对自动化和手动制备方案进行了对比，并对方案中的关键步骤进行了单独评估。这有效限制了自动化优化过程中的变量，最终缩短了脚本开发所需的时间。开发自动化捕获和酶解样品制备的这一方法，有助于准确、可重现地定量分析大鼠血浆中低至1 ng/mL的依那西普。

优势

自动化混合型LC-MS/MS分析的样品制备方法以实现高灵敏度、高重现性的蛋白质定量分析，可提供无人值守的样品制备，而这一任务通常需要科学家耗费近整整两天的时间来完成。

生物分析实验室的自动化液体移取器常用来简化和标准化样品制备工作流程，从根本上提高通量、减少误差及提升分析性能。虽然液体移取器常被用于执行连续稀释、蛋白质沉淀或固相萃取等简单的生物分析实验操作，但在复杂的多步骤工作流程（如蛋白质酶解）中，其应用效果却不尽如意。这可能是因为，达到准确定量生物基质中目标分析物所需的较高灵敏度涉及复杂的方法开发和步骤优化（如免疫亲和纯化和蛋白质酶解）。要成功自动化执行前文所述的蛋白质定量分析工作流程，需要对流程中的子步骤进行评估、验证和可能的重新优化，以确保其符合生物分析方法开发的严格标准。

本应用纪要旨在介绍开发混合型LC-MS/MS成功自动化定量融合蛋白依那西普(Enbrel)所用的捕获和酶解方法的过程。在定量分析之前，采用分步法对自动化和手动制备方案进行了对比，并对方案中的关键步骤进行了单独评估。这有效限制了自动化优化过程中的变量，最终缩短了脚本开发所需的时间。开发自动化捕获和酶解样品制备的这一方法，有助于准确、可重现地定量分析大鼠血浆中低至1 ng/mL的依那西普。

I. 用于免疫亲和纯化的Hamilton STAR工作台附件和实验室器皿

II.初步自动化方案开发：蛋白A捕获

a. 血浆样品制备：将英夫利昔单抗以10,000 ng/mL的浓度加标到大鼠血浆中。从制得的英夫利昔单抗样品中取65 μL转移到Waters 96孔板中，再置于STAR工作台上（图1）。 

b. 免疫亲和试剂：使用Magne蛋白A磁珠(Promega, G8781)纯化英夫利昔单抗。将Tris缓冲液(TBS, 25 mM Tris, 150 mM NaCl, pH 7.2)用作清洗/结合缓冲液，倒入大容量试剂储液瓶，再置于工作台上。将0.1%甲酸溶液用作洗脱溶液，同时使用500 mM碳酸氢铵(pH 8.0)溶液中和样品。将磁珠、洗脱溶液和中和缓冲液等份分装到小容量溶剂瓶中，再置于工作台上。

c. 免疫亲和样品纯化：以下步骤为手动操作或完全由STAR自动执行：

i. 向每份样品中加入200 μL TBS之后，再加入25 μL蛋白A磁珠浆液。将样品板混合30 s，静置2 min，让磁珠沉降到96孔板的磁体上。移除并丢弃全部上清液。

ii.按照与步骤i相同的方法清洗磁珠两次：加入250 μL TBS，混合30 s，沉降2 min，再移除上清液。

iii.要纯化英夫利昔单抗样品，将200 μL TBS和50 μL加标血浆或空白血浆加到磁珠上。在室温下混合(1300 rpm)样品1 h。温育之后，磁珠沉降，移除并丢弃全部上清液。

iv.使用200 μL TBS清洗磁珠两次，待磁珠沉降后，移除上清液。

  v. 加入80 μL洗脱溶液并在室温下混合(1300 rpm) 10 min，将磁珠上结合的英夫利昔单抗洗脱下来。移除样品洗脱液，然后转移到干净的96孔板中。再加入8 μL中和缓冲液中和样品。

d. 酶解：样品纯化后，立即使用ProteinWorks Auto-eXpress Low 5快速酶解试剂盒进行酶解（详见第IV部分）。

III.自动化方案开发：山羊抗人IgG捕获

a. 血浆样品制备：

i. 对比研究：向大鼠血浆中加标10,000 ng/mL的依那西普，制备四个重复样。使用英夫利昔单抗和曲妥珠单抗作为内标(IS)，并用TBS稀释至10,000 ng/mL。从制得的依那西普样品中取65 μL转移到Waters 96孔板中，再置于STAR工作台上。 

ii.定量研究：向大鼠血浆中加标不同浓度的依那西普（浓度范围1.0-10,000 ng/mL），制得标准品和QC样品。使用曲妥珠单抗作为IS，并用TBS稀释至1,000 ng/mL。各标准品和QC样品均制备三个重复样。从制得的依那西普样品中取65 μL转移到Waters 96孔板中，再置于STAR工作台上。 

b. 免疫亲和试剂：将山羊抗人生物素化IgG抗体(Promega, V7830)与高容量Magne链霉亲和素磁珠(Promega, V7820)偶联，对依那西普和IS进行免疫纯化。将山羊抗人IgG抗体、洗脱溶液（0.1%甲酸）和中和缓冲液（500 mM碳酸氢铵，pH 8.0）加入到小容量试剂储液瓶中。将TBS溶液加入到大容量试剂储液瓶中，再将所有的溶剂瓶置于STAR工作台上。

c. 免疫亲和样品纯化：在对比研究中，以下步骤为手动操作或完全由STAR自动执行；在依那西普定量研究中，以下步骤完全由STAR自动完成：

i. 磁珠负载：

1. 在96孔板中，向每个样品要使用的板孔中加入200 μL TBS，然后加入25 μL链霉亲和素磁珠浆液。将样品板混合30 s，静置2 min，让磁珠沉降到96孔板的磁体上。移除并丢弃全部上清液。

2. 按照与步骤i相同的方法清洗磁珠两次：加入250 μL TBS，混合30 s，沉降2 min，再移除上清液。

3. 要让磁珠负载，将50 μL生物素化山羊抗人IgG抗体加到磁珠上。在室温下混合(1300 rpm)样品 2 h。

4. 磁珠负载后，用200 µL TBS稀释样品，混合(1300 rpm)，沉降2 min，然后移除上清液。 

5. 按照与步骤i相同的方法清洗磁珠两次：加入200 μL TBS，混合30 s，沉降2 min，再移除上清液。

ii.免疫亲和样品纯化：

1. 要纯化样品，将200 μL TBS、50 μL IS和50 μL加标依那西普的血浆或空白血浆加到已负载的磁珠上。 

2. 在室温下混合(1300 rpm)样品和磁珠一整晚。温育之后，磁珠沉降，移除并丢弃全部上清液。

3. 使用200 µL TBS清洗磁珠两次，并移除上清液。

4. 要从磁珠上洗脱结合的依那西普和IS，加入80 μL洗脱溶液并在室温下混合(1300 rpm) 10 min。移取样品洗脱液，转移到干净的96孔板中，再加入8 μL中和缓冲液中和样品。

d. 酶解：样品纯化后，立即使用ProteinWorks Auto-eXpress Low 5快速酶解试剂盒进行酶解（详见第IV部分）。

IV.蛋白质酶解

a. 用于蛋白A方法开发的蛋白质酶解方案（第II部分）：使用ProteinWorks Auto-eXpress Low 5快速酶解试剂盒（部件号：176004078）及提供的小体积方案对纯化后的全部上清液(≈ 88 µL)进行酶解。Low 5酶解方案包括：变性、还原、烷基化、酶解和淬灭步骤。此酶解方案为手动执行。

b. 用于山羊抗人抗体方法开发的蛋白质酶解方案（第III.a部分）：使用ProteinWorks Auto-eXpress Low 5快速酶解试剂盒及提供的小体积方案对纯化后的全部上清液(≈88 μL)进行酶解。Low 5酶解方案包括：变性、还原、烷基化、酶解和淬灭步骤。此酶解方案为手动执行。

c. 用于山羊抗人抗体定量分析的蛋白质酶解方案（第III.b部分）：使用ProteinWorks Auto-eXpress Low 5快速酶解试剂盒及提供的小体积方案对纯化后的全部上清液(≈88 μL)进行酶解。Low 5酶解方案包括：变性、还原、烷基化、酶解和淬灭步骤。此酶解方案由Hamilton STAR执行。自动化酶解和手动酶解的对比请参阅沃特世应用纪要720006208EN；自动化脚本的性能请参阅沃特世应用纪要720006165EN和720006209EN。

融合蛋白属于生物制剂市场，据估计，到2025年，该市场份额将达到3995亿美元²。 虽然融合蛋白只占制药市场的一小部分（单克隆抗体占据市场主导地位），但融合蛋白依那西普是2017年销量最高的五种药物之一，全球销售额高达79.8亿美元³。 随着大分子生物治疗药物的不断发展，市场对开发出能够准确定量生物基质中的大分子药物以供药物发现和研究之用的方法的需求也在持续增加。通过LC-MS对蛋白质进行定量分析通常需要将蛋白质酶解为更小的肽段。由于该方法涉及许多步骤和多种试剂，整个方法开发过程非常耗时且复杂。除此之外，通常还需要在酶解之前对样品进行免疫亲和纯化，以提高分析选择性和灵敏度，这进一步增加了整个过程的复杂程度。

LC-MS

鉴定和优化特征性胰蛋白酶解肽是成功开发MS方法的关键。依那西普（图2）含有高丰度的N-糖基和O-糖基，因此用特征性肽段方法对其进行定量尤其困难。要测定糖基化肽（糖肽），在设置MRM通道的质量数时必须考虑糖基的质量数，或不得不使用酶去除糖基。由于已有大量文献报道过依那西普的糖基化位点，本研究采用Skyline（华盛顿大学MacCoss 实验室）⁴进行模拟酶解，以确定是否存在任何非糖基化特征性肽段。鉴定出两种非糖基化肽之后，通过实验确定MRM方法的开发和优化，实验时使用缓冲液中依那西普的胰蛋白酶酶解物，在Xevo TQ-XS MS上执行Skyline/MassLynx工作流程。针对英夫利昔单抗和曲妥珠单抗的MRM方法开发遵循与依那西普相同的流程，并使用Skyline和MassLynx进行优化。图2所示为依那西普的氨基酸序列，定量分析所用的特征性肽段以绿色突出显示。表1所列为适用于依那西普胰蛋白酶解肽的经过优化的MS条件和MRM通道。

依那西普胰蛋白酶解肽的色谱分离通过使用ACQUITY UPLC BEH C₁₈, 300 Å, 1.7 µm, 2.1 × 150 mm肽分析专用柱实现。流动相B在7.5 min内从2%增加到40%的缓梯度可提供最佳的色谱性能，确保极性CSSDQVETQACTR (CSS)肽得以保留。

自动化样品制备策略

成功开发自动化策略的首要步骤之一是开发可执行手动工作流程中所有任务的自动化脚本。应使用水测试来目视验证各种设备运动和液体处理是否成功。接着，参照手动工作流程测试自动化流程的性能。再使用手动和自动化策略分析离散样品组，以验证脚本的初始性能。证明手动和自动化性能的可比性，可确保从手动策略改用自动化策略后仍能达到之前希望保留的分析性能。性能对比完成后，必须设计更多的实验来评估自动化工作流程的总体定量性能。在本研究中，证明自动化和手动捕获的性能在内部指南规定的可接受范围内之后（峰面积+/-15%，RSD <20%），使用全套校准标准品和QC样品进行了全面的定量性能评估。

优化自动化免疫亲和蛋白质纯化方案

众所周知，免疫亲和纯化成本高昂。根据纯化的特异性（从通用纯化到特异性纯化），每个样品的成本通常在4~20美元之间。这是许多科学家选择通用捕获方法（例如选择性较低的蛋白A）而非特异性捕获方法（例如来自临床前物种的山羊抗人抗体）的一个主要原因。另外，开发此类昂贵且复杂的产品非常耗时，且难度极大。鉴于这些原因，亲和纯化自动化脚本的开发最初使用价格较低且对人IgG1具有较高结合亲和力的蛋白A（通用亲和捕获）进行测试。 

此机制会捕获药物中的人IgG1组分，然后洗脱未结合的组分，留下去除了非特异性蛋白质的纯化样品（图3）⁵。 更重要的是，蛋白A磁珠捕获（第II.c部分）的步骤与山羊抗人IgG的纯化步骤（第III.c.ii部分）相同，使其成为开发亲和自动化脚本的理想之选。成功自动化蛋白A磁珠捕获之后，即已成功自动化抗人抗体捕获的第二部分。

确定STAR实验室器皿

确定合适的实验室器皿是分析过程自动化的一个关键方面。在手动操作中看似不重要的实验室器皿或附件，如果选择不当，可能会影响自动化过程的重现性。这可能导致分析性能不佳，并需要耗时的方法开发，以进行纠正。在开始分析测试之前，应单独测试各实验室器皿的兼容性。

在开发自动化方案之前，对蛋白A磁珠纯化方法进行了手动优化。这样一来，只需优化自动化步骤即可。优化方法可参见“实验”部分。需要注意的主要观察结果包括：

• 使用磁珠时，所有混合步骤都应使用圆底或较宽的V形底孔板。在涡旋过程中，由于PCR板的板孔呈锥形，使用PCR板无法充分搅拌磁珠，回收率会受影响。
• 96孔深孔板过高，无法置于STAR深孔板位置的Alpaqua磁体上。必须使用较矮且体积较小的96孔板。
• 在纯化样品和储存任何纯化后的样品时，都应使用低吸附样品板，最大程度地减少非特异性结合或样品损失。

综合以上原因，本研究选用Eppendorf低蛋白质吸附500 μL孔板实施磁珠纯化样品制备方案的自动化，可满足如上所述使用96孔板自动化该工作流程的所有要求。

自动化的另一个难点是为应用选择适当的实验室器皿。通过研究免疫亲和工作流程的各个步骤，可以确定自动化所需的基本组件。使用磁珠进行mAb免疫捕获（通用捕获或特异性捕获）的基本步骤包括：移液、样品混合和磁珠分离。  为了将这些步骤自动化，所用的液体移取器必须满足以下要求：

• 配备4-12个移液器通道，而不是使用96孔枪头来解决高成本试剂（如磁珠和抗体）可用量受限的问题
• 配备涡旋装置，用于混合96孔板
• 磁体，用于从96孔板中分离出磁珠
• 大容量(>100 mL)液体溶剂瓶，用于盛装清洗缓冲液和废液
• 小容量(<10 mL)液体溶剂瓶，用于盛装磁珠、洗脱溶液和中和缓冲液，以及抗体溶液

Hamilton STAR工作台进行磁珠免疫亲和纯化的最终布局如图1所示。

磁珠处理

磁珠纯化自动化的另一个困难步骤是可重现地吸取和分配磁珠浆液。即使不使用磁体，磁珠也会快速沉降到任何溶剂瓶的底部，因此必须通过移液枪头混合操作重新吸打磁珠，确保磁珠浆液可重现地分配到每个样品中，这一点非常重要。否则，各个样品中的磁珠浓度会有差异，进而影响线性或导致样品纯化效果不一致。为此，可通过强制吸取磁珠浆液并释放回试剂储液瓶中，帮助磁珠在整个浆液中分散。

对比研究：自动化与手动免疫亲和纯化

优化自动化免疫亲和纯化方案之后，本研究成功对比了英夫利昔单抗的自动化与手动蛋白A捕获结果（图4）。  峰面积性能和%RSD完全符合内部指南中的可接受标准：自动方案的峰面积为手动方案的峰面积+/-15%，RSD低于20%。鉴于采用自动化方案获得了与手动方案相当的性能，可进一步开发山羊抗人IgG免疫亲和纯化方案。

除蛋白A捕获步骤外，抗人抗体方案还有一个前期负载步骤，在这个步骤中，生物素化的山羊抗人IgG抗体负载到链霉亲和素磁珠上，其原理如图5所示⁶。  为确保成功完成负载步骤（将决定整个抗人抗体方案能否成功），负载操作模拟纯化的每一个清洗步骤，即采用移液器混合相同的溶液体积，并采用相同的速度和高度。 

图6所示为TBS中加入英夫利昔单抗和曲妥珠单抗作为内标的依那西普加标血浆的自动化和手动工作流程对比。由于自动化抗人抗体纯化方案得到的依那西普峰面积和IS峰面积在手动方案峰面积的15%以内，且%RSD变化小于10%，因此可以通过全面的定量分析来评估自动化方法。

定量研究：自动化免疫亲和捕获和样品酶解

将校准曲线标准品和QC样品加入到大鼠血浆中，捕获蛋白质，然后在Hamilton STAR上进行酶解（第III和IV部分）。表3突出显示了校准曲线的线性动态范围和定量分析统计数据。统计数据表明，即使经过了多个复杂的样品制备步骤，该分析仍具有良好的重现性和准确度，线性拟合相关系数>0.99，QC准确度在+/-10%以内（表4），LOQ为1 ng/mL。 

采用这一结合亲和捕获和酶解步骤的自动化样品制备方法，分析结果满足生物分析方法验证指南的精密度和准确度要求，QC准确度在96%-107%之间，且RSD ≤10%。QC样品中ICTCRPGWYCALSK (ICT)肽的示例色谱图如图7所示。

经证实，自动化能够提高实验室分析效率，减少人为误差，及确保分析之间的重现性。然而，蛋白质酶解等多步骤样品制备策略可能既繁琐又耗时。为达到高灵敏度而必须对基质进行前期免疫亲和纯化时，这一问题尤其突出。采取分步方案并单独评估该过程中的关键步骤，可以减轻方法开发过程中的繁重任务。此外，蛋白质酶解时采用经过优化的标准化试剂盒方法，可以简化其中一个关键步骤的方法开发。最后，可以将先前经过优化的手动流程作为方法自动化的性能参考或起点。 

使用该策略开发自动化脚本提出了一种灵敏度高、准确度高且重现性出色的混合型LC-MS/MS方法，该方法通过分析特征性肽段进行蛋白质定量分析。在Hamilton STAR系统上使用经过验证的ProteinWorks Auto-eXpress快速酶解试剂盒自动化脚本之前进行免疫亲和纯化流程的自动化，能够稳定地定量分析大鼠血浆中的依那西普，LLOQ达1 ng/mL。如果开发得当，复杂工作流程（如蛋白质定量分析）的自动化可以最大程度地减少人为错误、提高通量及最大化分析效率，同时获得准确且可重现的性能。

1. Quality Assurance (2017 Mar) Advances in LC/MS methodologies for the characterization of complex glycoproteins – case study: etanercept.Delobel, A., Retreived from: https://www.slideshare.net/quality_assistance/advances-in-lcms-methodologies-for-the-characterisation-of-complex-glycoproteins-case-study-etanercept-73017727.
2. Grand View Research (2017 Mar) Biologics market size worth $399.5 billion by 2025 |growth rate: 3.9%.Retrieved from: https://www.grandviewresearch.com/press-release/global-biologics-market.
3. Igea Hub Pharmaceutical Club (2018 Apr) The complete list and analysis of the best selling drugs in 2017 | All the top products in the pharmaceutical and biotechnology industry with detailed performance and future trends.Retrieved from: https://www.igeahub.com/2018/04/07/20-best-selling-drugs-2018/.
4. Skyline targeted mass spec environment (2017) Downloaded June 2017 from https://skyline.gs.washington.edu/labkey/project/home/software/Skyline/begin.view.
5. Schematic of Antibody Purification using Magne Protein A Beads or Magne Protein G Beads | Promega.Retreived from https://www.promega.com/products/protein-purification/antibody-purification/magne-protein-g-and-magne-protein-a-beads/?catNum=G8782.
6. Highly Specific Binding | Promega.Retrieved from https://www.promega.com/products/protein-purification/antibody-purification/high-capacity-magne-streptavidin-beads-and-goat-anti-human-biotinylated-igg/?catNum=V7820.