• 应用纪要

使用Oasis PRiME MCX高效萃取血浆中的喹硫平

使用Oasis PRiME MCX高效萃取血浆中的喹硫平
  • Michelle Wills
  • Lisa J. Calton
  • Gareth Hammond
  • Kim Haynes
  • Waters Corporation
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Quetiapine molecule structure

摘要

在本应用纪要中，我们使用三种样品萃取方案（蛋白沉淀法、Oasis MCX和Oasis PRiME MCX）对喹硫平进行分析，比较了三种方法中的分析物回收率和基质效应（包括磷脂去除率）。

优势

  • 更快速、更简单的样品制备工作流程
  • 与蛋白沉淀法相比，可去除至少98%的磷脂
  • 无需蒸发或复溶

简介

生物分析在药物发现和开发中发挥着重要作用，其中样品制备是获得可靠结果的关键步骤1。 为实验室开发高通量分析方法时，分析速度、方法稳定性和成本是必须考虑的重要因素。 

Oasis PRiME MCX是一款混合模式/强阳离子交换固相萃取(SPE)产品，相较于其它样品制备技术，该产品可通过去除磷脂萃取出更洁净的碱性化合物。在本应用纪要中，我们使用96孔µElution板，通过快速的3步方案（省去了传统固相萃取法(SPE)的活化和平衡步骤）成功萃取了人血浆中的喹硫平。 

喹硫平的结构如图1所示。喹硫平为二苯并硫氮杂卓衍生物，是一种用于治疗多种精神障碍的抗精神病药物。阳离子交换吸附剂是萃取这种碱性药物（胺的pKa为7.06）的理想之选。

喹硫平的结构。
图1.喹硫平的结构。

在本应用纪要中，我们使用三种样品萃取方案（蛋白沉淀法、Oasis MCX和Oasis PRiME MCX）对喹硫平进行分析，比较了三种方法中的分析物回收率和基质效应（包括磷脂去除率）。

实验

样品制备

将喹硫平（Sigma Aldrich，英国多塞特郡）加标至混合人血浆（Sera Laboratories，英国西萨塞克斯郡）中，制得浓度在2.5~100 ng/mL范围内的样品。此外，自制浓度为7.5 ng/mL、30 ng/mL和75 ng/mL的QC样品。 

样品提取

1. 蛋白沉淀法

移取100 µL血浆校准品/QC样品至带刻度的微量离心管中。

加入300 µL甲醇，使蛋白质沉淀。离心管加盖涡旋30 s，然后在13000 rpm的转速下离心5 min。

2. Oasis MCX

移取100 µL血浆校准品/QC样品至带刻度的微量离心管中。向每个样品中加入100 µL 4%磷酸，以破坏蛋白质结合，同时使分析物质子化，促进离子交换相互作用。离心管加盖涡旋30 s，然后在13000 rpm的转速下离心5 min。将上清液转移至已经过甲醇活化并用水进行了平衡的Oasis MCX 96孔µElution板中。然后依次用2%甲酸水溶液和100%甲醇清洗萃取板。再用2 x 25 µL 5%氨化甲醇溶液洗脱，最后用50 µL水稀释洗脱液。在分析之前，将样品板密封并轻轻涡旋30 s。

3. Oasis PRiME MCX

移取100 µL血浆校准品/QC样品至带刻度的微量离心管中。向每个样品中加入100 µL 200 mM甲酸铵（含4%磷酸），以破坏蛋白质结合，同时使分析物质子化，促进离子交换相互作用。离心管加盖涡旋30 s，然后在13000 rpm的转速下离心5 min。将上清液转移至Oasis PRiME MCX 96孔µElution板中，并用100%甲醇进行清洗。然后用2 x 25 µL 5%氨化甲醇溶液洗脱，最后用50 µL水稀释洗脱液。在分析之前，将样品板密封并轻轻涡旋30 s。 

固相萃取步骤汇总于图2。

与传统SPE萃取方案比较，Oasis PRiME MCX方案由于省去了活化和平衡步骤，被简化为仅有3步。
图2. 与传统SPE萃取方案比较，Oasis PRiME MCX方案由于省去了活化和平衡步骤，被简化为仅有3步。

LC条件

LC系统：

ACQUITY UPLC I-Class系统(FTN)

色谱柱：

ACQUITY UPLC CSH C18, 1.7 μm, 2.1 x 100 mm（部件号：186005297）

流动相A：

0.1%甲酸的水溶液

流动相B：

甲醇

清洗溶剂：

80%甲醇水溶液和0.1%甲酸

灌注溶剂：

20%甲醇水溶液和0.1%甲酸

密封清洗液：

20%甲醇水溶液

柱温：

45 °C

样品温度：

10 °C

进样体积：

5 μL

流速：

0.4 mL/min

梯度：

见表1

运行时间：

4.3 min（两次进样之间约5.0 min）
用于分离喹硫平的梯度表。
表1.用于分离喹硫平的梯度表。

MS条件

系统：

Xevo TQD

分辨率：

MS1和MS2 (0.75 FWHM)

采集模式：

多重反应监测(MRM)（详见表2）

极性：

ESI+

毛细管电压：

0.5 kV

锥孔电压：

见表2

离子源温度：

150 °C

脱溶剂气温度：

600 °C

驻留时间：

0.05 s

扫描间延迟时间：

0.02 s

通道间延迟时间：

0.01 s
喹硫平定性离子和定量离子的MRM参数指导值。
表2. 喹硫平定性离子和定量离子的MRM参数指导值。

数据管理

带TargetLynx定量应用软件的MassLynx 4.1版

结果与讨论

回收率

分析代表了整个浓度范围的三个样品，每个样品重复分析6次，以确定蛋白沉淀法、Oasis MCX和Oasis PRiME MCX样品萃取法的萃取回收率。使用如下公式计算萃取回收率：

%回收率 = (峰面积A/峰面积B) x 100

其中，A是萃取样品的峰面积，B是萃取基质样品（在萃取之后加入喹硫平）的峰面积。如表3所示，使用Oasis MCX（平均回收率94.5%）和Oasis PRiME MCX（平均回收率94.0%）时，各个浓度的样品都获得了优异的喹硫平萃取回收率和精度，然而，蛋白沉淀法的回收率非常差（平均回收率仅为27.7%）。

蛋白沉淀法(PPT)、Oasis MCX和Oasis PRiME MCX方案的精度(%RSD)和萃取回收率（%回收率）。
表3.蛋白沉淀法(PPT)、Oasis MCX和Oasis PRiME MCX方案的精度(%RSD)和萃取回收率（%回收率）。

基质效应和磷脂去除

分析代表了整个浓度范围的三个样品，每个样品重复分析6次，以确定蛋白沉淀法、Oasis MCX和Oasis PRiME MCX样品萃取方案的基质效应。使用如下公式计算基质效应：

基质效应 = ((存在基质时的峰面积/无基质时的峰面积)-1) x 100

“存在基质时的峰面积”是指在萃取之后加入喹硫平制得的萃取基质样品的峰面积。“无基质时的峰面积”是指用溶剂配制的喹硫平溶液的峰面积。 

使用蛋白沉淀法时，观察到显著的基质效应；平均基质效应为-58.4%（在-56.4%～-59.6%范围内），这表示存在严重的离子抑制。使用混合模式/强阳离子交换固相萃取时，观察到的基质效应可以忽略不计，其中Oasis MCX的平均基质效应为-2.7%（在0～-4.3% 的范围内），而Oasis PRiME MCX的平均基质效应为-0.1%（在-1.9%～1.2%的范围内）。

为了评估磷脂去除率，我们进行了母离子扫描实验，对三种萃取方案所得的血浆样品萃取物中m/z 184离子的母离子进行监测。以磷脂含量最高的蛋白沉淀法萃取物为基准，对磷脂峰面积进行归一化处理。图3比较了蛋白沉淀法、Oasis MCX和3步Oasis PRiME MCX方案得到的血浆样品萃取物中的磷脂浓度，结果表明3步Oasis PRiME MCX方案的磷脂去除率高达98%，远高于蛋白沉淀法。

使用蛋白沉淀法、Oasis MCX和Oasis PRiME MCX得到的萃取血浆样品中磷脂浓度的柱形图。
图3.使用蛋白沉淀法、Oasis MCX和Oasis PRiME MCX得到的萃取血浆样品中磷脂含量的柱形图。

结论

与蛋白沉淀法相比，配合3步法的Oasis PRiME MCX方案去除了98%的磷脂，而且结果重现性优异，所得萃取物更洁净，基质效应可忽略不计。 

尽管蛋白沉淀法是一种低成本的样品制备方法，但该方法的基质效应显著，因此样品净化效率可能较差，进而会影响生物分析方法的稳定性。

µElution板采用精简的3步法方案，所得的血浆萃取物无需蒸发和复溶即可直接进样分析，为分析人员提供了一个快速的工作流程。该方法采用SPE规格的装置和萃取方案，可使用自动化液体处理设备轻松实现自动化，从而改进实验室工作流程，消除人为操作错误并实现样品追踪功能。

参考文献

  1. Mohammad MaHDI Moeina, Aziza El Beqqalib, Mohamed Abdel-Rehimb.Bioanalytical method development and validation: Critical concepts and strategies.J Chromatography B.2017; 1043:3–11.

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