在临床研究中使用Oasis PRiME HLB对血清中的维生素D代谢物进行LC-MS/MS分析的优势

本研究为血清中25OHD₃、25OHD₂、C3-epi-25OHD₃和24,25(OH)₂D₃的LC-MS/MS分析成功开发出了一种临床研究方法。研究证明，Oasis PRiME HLB可去除磷脂的优势对于维生素D代谢物分析很有帮助，其具有以下优势：

• 使用精简的萃取工作流程去除血清样品中的磷脂
• 所有分析物在所有测试浓度水平均表现出优异的精度(≤ 8.2% CV)
• 将25OHD₃结果与DEQAS NIST指定值比较，观察到良好的一致性
• 有效提高了25OHD₃、25OHD₂、C3-epi-25OHD₃和24,25(OH)₂D₃的分析灵敏度，无需衍生化

优势

• 在维生素D的LC-MS/MS分析中，使用Oasis PRiME HLB可将磷脂干扰物含量降至最低，有效提高分析灵敏度，而无需耗时的衍生化步骤。

目的

开发一种用于分析25-羟基维生素D₃ (25OHD₃)、25-羟基维生素D₂ (25OHD₂)、24,25-二羟基维生素D₃ (24,25(OH)₂D₃)和C3-epi-25-羟基维生素D₃ (C3-epi-25OHD₃)的LC-MS/MS方法。本方法采用Xevo TQ-S micro质谱仪进行检测，并使用Waters Oasis® PRiME HLB最大限度减少磷脂干扰物和提高分析灵敏度。

背景

使用LC-MS/MS测定血清中的维生素D代谢物含量时，基质干扰物质会带来挑战。其中，疏水性与25-羟基维生素D (25OHD)相似的溶血磷脂酰胆碱（LysoPCs 16:0、18:1和18:0）尤为棘手，已有研究表明，在质谱分析过程中，这类物质会产生离子抑制。尽管LysoPCs的结构各不相同，但研究表明它们很难通过样品制备过程去除，也很难与维生素D代谢物实现色谱分离。

解决方案

本文介绍了一种使用Oasis PRiME HLB μElution固相萃取(SPE)板（图1）的优化方法，评估了该方法相较于Oasis HLB SPE和蛋白质沉淀法的LysoPCs去除性能。本研究使用Waters ACQUITY UPLC HSS PFP色谱柱分离三种样品萃取方法所得萃取物中的25OHD₂、25OHD₃、24,25(OH)₂D₃和C3-epi-25OHD₃，并将峰面积与萃取物中目标LysoPCs（16:0、18:1和18:0，母离子为m/z 496、m/z 522和m/z 524，子离子为m/z 184）的峰面积进行了对比。使用Waters ACQUITY UPLC I-Class (FTN)/Xevo TQ-S micro系统评估了优化后的萃取方法的性能。

样品制备与分析

将稳定的标记内标加入100 μL校准品、QC样品和测试样品中，使用甲醇/硫酸锌_{（水溶液）}进行蛋白质沉淀。 

离心之后，将上清液转移到Oasis PRiME HLB µElution板孔内。使不同浓度的乙腈_{（水溶液）}(0–100%)通过SPE吸附剂以洗脱分析物，使用每种浓度的洗脱溶液制备三个重复样，然后分析所得洗脱液，得到洗脱曲线。 

使用配备2.1 x 100 mm ACQUITY UPLC HSS PFP色谱柱的ACQUITY UPLC I-Class系统，以水、甲醇、醋酸铵和甲酸为流动相，梯度分离经过稀释的洗脱液，并在Xevo TQD上采用表1所列的MRM通道和母离子扫描参数进行检测。

将三个重复样中每种目标维生素D代谢物和LysoPCs的平均峰面积绘制成散点图，得到其洗脱曲线（图2）。

通过洗脱曲线可以看出，LysoPCs开始从Oasis PRiME HLB吸附剂中洗脱出来时的有机溶剂浓度与维生素D代谢物开始洗脱出来时的有机溶剂浓度接近，这是因为它们的疏水性相似。但是，当乙腈_{（水溶液）}的浓度> 90%时，几乎所有LysoPCs都保留在了Oasis PRiME HLB SPE吸附剂上，而维生素D代谢物成功洗脱。因此，优化方法选择以25%乙腈_{（水溶液）}作为清洗溶液，以100%乙腈作为洗脱溶液。

我们对比了优化Oasis PRiME HLB方法、使用甲醇/硫酸锌_{（水溶液）}的简单蛋白质沉淀萃取法，以及使用甲醇作为洗脱溶剂的优化Oasis HLB方法这三种方法得到的LysoPCs和维生素D代谢物平均峰面积。结果汇总于图3。

与使用甲醇的Oasis HLB方法和蛋白质沉淀法相比，使用乙腈的Oasis PRiME HLB方法去除了99%以上的目标LysoPCs。因此，使用该方法得到的维生素D代谢物峰面积比Oasis HLB方法增加了5倍，比蛋白质沉淀方案增加了10倍。

我们使用ACQUITY UPLC I-Class/Xevo TQ-S micro系统评估了优化后的萃取方法的性能。连续五天的实验结果显示，25OHD₃、25OHD₂、C₃-epi-25OHD₃和24,25(OH)₂D₃在下列浓度范围内（表2）的所有校准曲线相关系数(r²)均> 0.99，表中还列出了nmol/L到ng/mL的换算系数。

ACQUITY UPLC HSS PFP色谱柱成功分离了C3-epi-25OHD与25OHD（包括25OHD₂和25OHD₃）。24,25(OH)₂D₃定量和定性通道中均存在的一个同分异构体峰也分离了出来，经确认为25,26(OH)₂D₃。图4所示为示例色谱图，表明进样之间的运行时间< 8 min。

连续五天萃取低、中、高浓度的血清样品（每个浓度制备五个重复样，n=25）并进行定量分析，以评估方法的总精度和重复性。如表3所示，所有结果均≤ 8.2%CV。

通过分析DEQAS（维生素D外部质量评估计划）样品和NIST SRM972a（美国国家标准技术研究所(NIST)标准参比物质972a）评估方法的准确性，然后将计算所得的浓度与NIST指定值对比。25OHD₃的Deming回归方程为y=1.02x-1.09，Altman Bland分析结果表明其一致性良好（最小偏差仅为-0.1%）。25OHD₂只有七个数据点可用，与NIST指定值对比得出的总体平均百分比偏差为-0.9%（在-9.7%~10.0%范围内）。虽然对于C3-epi-25OHD₃ DEQAS样品的结果呈现明显的分散趋势，但其结果与NIST SRM972a参比标准物质对比呈现出良好的一致性，所有被测样品的偏差都在±6.7%以内（使用含有C3-epi-25OHD₃的三个样品制备三个重复样）。对比DEQAS试验性研究得出的LC-MS/MS ALTM值评估15个样品的24,25(OH)₂D₃分析结果，同样观察到结果呈现明显的分散趋势（NIST没有指定值）。LC-MS/MS ALTM值仅来源于六个实验室，参与实验室返回的结果之间的标准偏差较大。

分三天在经过处理的血清样品中加标低、中、高浓度的分析物并进行样品萃取（每个浓度制备10个重复样，n=30），根据分析结果评估分析灵敏度。加标浓度为1 nmol/L时的25OHD₃和25OHD₂分析结果，以及加标浓度为0.5 nmol/L时的24,25(OH)₂D₃和C3-epi-25OHD₃分析结果均达到了< 20%CV的精度，且S:N (ptp) > 10:1。

本研究为血清中25OHD₃、25OHD₂、C3-epi-25OHD₃和24,25(OH)₂D₃的LC-MS/MS分析成功开发出了一种临床研究方法。研究证明，Oasis PRiME HLB可去除磷脂的优势对于维生素D代谢物分析很有帮助，其具有以下优势：

• 使用精简的萃取工作流程去除血清样品中的磷脂
  
• 所有分析物在所有测试浓度水平均表现出优异的精度(≤ 8.2% CV)
• 将25OHD₃结果与DEQAS NIST指定值比较，观察到良好的一致性
  
• 有效提高了25OHD₃、25OHD₂、C3-epi-25OHD₃和24,25(OH)₂D₃的分析灵敏度，无需衍生化