• 应用纪要

快速、简单、有效地净化牛肝样品用于多兽药残留UPLC-MS/MS分析

快速、简单、有效地净化牛肝样品用于多兽药残留UPLC-MS/MS分析
  • Michael S. Young
  • Kim Van Tran
  • Waters Corporation
下载PDF
Red angus cattle closeup

摘要

本研究在LC-MS/MS分析前采用新型反相吸附剂Oasis PRiME HLB实现了牛肝提取物中磷脂和脂肪的高效去除。采用该新型吸附剂所得的兽药回收率结果与通过C18净化后获得的结果相类似。但是，经简单的通过式SPE流程处理后，可有效去除组织提取物中95%以上的磷脂和85%以上的脂肪。

优势

  • 高效、省时的多种类多残留方法
  • 简单、快速且有效的样品净化，适用于多种分析物
  • 快速、灵敏的UPLC-MS/MS分析

概述

为了保障公众健康和安全，人们亟需一种可靠的分析方法对食用组织样品（如牛肝）中的兽药残留水平进行测定。样品中的目标化合物涵盖了强极性的水溶性化合物到完全非极性的脂溶性化合物。为了实现最大化的通量和最少的成本，分析人员期望能够通过一个分析方法测定组织样品中的各种兽药残留。

简介

采用LC-MS测定兽药残留时，通常会使用乙腈溶剂对牛肉和牛肝等组织样品进行萃取。其中，最显著的共萃取物质为脂肪和极性脂质，特别是磷脂（卵磷脂）。1克牛肝中通常含有约45 mg脂肪，肌肉组织中脂肪含量通常为肝脏中的一半，但仍然很显著。牛肝还是优质卵磷脂（磷脂）的膳食来源；1克肝脏中含有约25 mg磷脂，是肌肉中常见含量的大约四倍。早期方法利用正己烷进行液液萃取或通过采用十八烷基硅胶(C18)的SPE固相萃取可去除组织提取液（乙腈体系）中的脂肪。虽然反相吸附剂C18能够有效去除大多数非极性脂质，但无法去除磷脂。过量的磷脂会缩短液相色谱柱的使用寿命，导致离子抑制并污染质谱仪。本研究在LC-MS/MS分析前采用新型反相吸附剂Oasis PRiME HLB实现了牛肝提取物中磷脂和脂肪的高效去除。采用该新型吸附剂所得的兽药回收率结果与通过C18净化后获得的结果相类似。但是，经简单的通过式SPE流程处理后，可有效去除组织提取物中95%以上的磷脂和85%以上的脂肪。

实验

UPLC条件

LC系统：

ACQUITY UPLC I-Class 配备固定环式样品管理器

色谱柱：

ACQUITY UPLC CSH C18, 1.7 μm, 2.1 mm x 100 mm（内径）

流动相：

A：0.1%甲酸水溶液

B：0.1% 甲酸的50:50乙腈/甲醇溶液

进样体积：

7 μL

进样模式：

部分定量环进样

柱温：

30 °C

弱洗针液：

10:90乙腈:水(600 μL)

强洗针液：

50:30:40水:乙腈:异丙醇(200 μL)

密封清洗液：

10:90乙腈:水

梯度

时间(min)

流速(mL/min)

%A

%B

0.0

0.4

99.0

1.0

4.0

0.4

80.0

20.0

5.0

0.4

50.0

50.0

7.0

0.4

1.0

99.0

10.0

0.4

1.0

20.0

10.1

0.4

99.0

1.0

12.0

0.4

99.0

1.0

MS条件

质谱仪：

Xevo TQ-XS

模式：

正离子电喷雾

离子源温度：

150 °C

脱溶剂气温度：

400 °C

脱溶剂气流速：

1000 L/h

锥孔气流速：

30 L/h

碰撞气体流速：

0.15 mL/Min

数据管理：

MassLynx 4.1版
本研究使用化合物的MRM通道（初级通道在前）、仪器参数和保留时间(RT)。
表1.本研究使用化合物的MRM通道（初级通道在前）、仪器参数和保留时间(RT)。

样品前处理

1.初步萃取/沉淀：

将2 g组织样品置于带陶瓷均质器球的15 mL离心管中（该步骤使用的是Bertin Technologies公司Precellys® Evolution均质器）。对于标准品或QC样品，样品中应加入适量的所需分析物。向离心管中加入10 mL 0.2%甲酸的85:15乙腈/水溶液，样品匀浆/萃取1.5分钟，然后在3200 rcf的转速下离心5分钟。

注：萃取/沉淀步骤使大多数目标化合物能够获得良好的回收率，但是也提取了大量脂肪和磷脂。

2.通过式SPE净化：

将Oasis PRiME HLB小柱（6 cc，200 mg）安装在预先清洁过的真空导管上。不需要进行小柱活化，本实验也未执行此步骤。真空设置为2 psi。取0.6 mL上清液，使其通过Oasis PRiME小柱并弃去滤液。然后安装收集管，取1 mL上清液通过Oasis PRiME小柱并收集滤液。取200 µL滤液，在UPLC-MS/MS分析之前用400 µL 10 mM甲酸铵缓冲液(pH 4.5)进行稀释。

结果与讨论

图1为组织样品重复平行加标分析(n = 6)获得的回收率数据。基质效应平均值约为40%。图2所示的色谱图展示了Oasis PRiME HLB小柱的净化效果，该小柱可去除牛肝提取物中95%以上的磷脂，同时还可去除90%以上的正己烷可提取的脂肪。

图1.牛肝样品的加标回收率数据：低浓度（10 ng/g，以蓝色显示）和高浓度（100 ng/g，以红色显示）。
图1.牛肝样品的加标回收率数据：低浓度（10 ng/g，以蓝色显示）和高浓度（100 ng/g，以红色显示）。
LC-MS/MS色谱图显示该方法有效去除了牛肝提取物中95%以上的磷脂。
图2.LC-MS/MS色谱图显示该方法有效去除了牛肝提取物中95%以上的磷脂。

讨论

本研究中采用的步骤是我们综合了以前开发的方法1,2。整个方法的回收率平均大于70%，但一些强极性类化合物（如四环素类）的回收率较低。尽管单溶剂萃取步骤不可能对于所有目标化合物均有效，但是对于大多数回收率较低的化合物，其信号响应和重现性对于靶向筛查分析而言是可接受的。研究人员很有必要了解样品净化步骤对任何目标物的回收率损失的影响。图3所示的SPE回收率数据是牛肝样品经过溶剂萃取后，在SPE净化前进行加标后再过柱净化得到的。这些数据表明：对于大多数目标化合物，Oasis PRiME HLB净化小柱对回收率的影响很小。然而，对于伊维菌素、莫能菌素、莫昔克丁和新生霉素，萃取后净化确实会引起明显的回收率损失。有关这些分析物的更多信息将在以后的工作中予以介绍。 

样品经初步提取后，在Oasis PRiME HLB通过式净化前加标后再过柱得到的兽药化合物回收率。
图3.样品经初步提取后，在Oasis PRiME HLB通过式净化前加标后再过柱得到的兽药化合物回收率。

结论

  • 本研究开发了一种简单且有效的萃取/蛋白质沉淀方案，适用于牛肝组织中多兽药的筛查分析
  • 采用Oasis PRiME HLB小柱的简单通过式净化方案能够去除初步提取液中90%以上的脂肪和磷脂
  • 通过本文的样品制备方法得到的净化液因不含颗粒，故在LC-MS分析前无需进行过滤操作
  • 使用简单的Oasis PRiME HLB小柱的一步通过式净化方案，多种兽药均表现出一致的回收率

参考文献

  1. M. Young and K. Tran, “Oasis PRiME HLB Cartridge for Effective Clean-up of Meat Extracts Prior to Multi-Residue Veterinary Drug UPLC-MS Analysis”, Waters Application Brief, 2015.
  2. S. Lehotay, “High-Throughput Screening Analysis by UHPLC-MS/MS of >60 Veterinary Drugs in Animal Tissues”, 125th AOAC Annual Meeting, Presentation 2303, 21 September, 2011.

特色产品

可在线购买：

720005887ZH，2017年3月

返回顶部 返回顶部