• 应用纪要

用于临床研究的血浆中5-氟尿嘧啶的分析方法

用于临床研究的血浆中5-氟尿嘧啶的分析方法
  • Stephen Balloch
  • Lisa J. Calton
  • Gareth Hammond
  • Waters Corporation
下载PDF 下载PDF

仅供研究使用，不适用于诊断。

摘要

本文介绍了一种临床研究方法，该方法在添内标（5-氟尿嘧啶-13C15N2）之后，对血浆样品进行液液萃取。

优势

  • 利用色谱和高选择性的质谱检测提高分析选择性
  • 宽动态范围（范围拓宽100倍）
  • 样品制备过程简单、经济，仅使用极少量的样品
  • 分析速度快

简介

5-氟尿嘧啶是一种抗肿瘤制剂，通过干扰脱氧核糖核酸(DNA)合成以及小范围抑制核糖核酸(RNA)形成抑制肿瘤生长。由于5-氟尿嘧啶代谢的个体差异非常大1，灵敏度和选择性俱佳的测定方法将有助于5-氟尿嘧啶的药代动力学和药效动力学临床研究。

本文介绍了一种临床研究方法，该方法在添内标（5-氟尿嘧啶-13C15N2）之后，对血浆样品进行液液萃取。然后使用配备Waters ACQUITY UPLC HSS PFP色谱柱(2.1 × 100 mm, 1.8 µm)的ACQUITY UPLC I-Class系统进行色谱分离，所需时间仅为3 min，最后在Xevo TQD质谱仪上进行检测（图1）。

图1. ACQUITY UPLC I-Class系统与Xevo TQD。

实验

样品前处理：5-氟尿嘧啶认证参比标准品及其稳定标记内标(13C15N2)购自Toronto Research Chemicals（加拿大安大略省多伦多）。使用购自Golden West Biologicals(美国加利福尼亚州特曼库拉)的混合血浆作为替代基质制备标准曲线样品品。5-氟尿嘧啶的标准曲线范围为20~2000 ng/mL。使用相同的混合血浆分别制备浓度为40、350、750和1500 ng/mL的QC样品。 

样品萃取：向50 µL样品中添加5 µL 10 µg/mL溶于甲醇的内标(ISTD)，旋涡混合30 s。加入500 µL含0.1%甲酸（体积比）的乙酸乙酯溶液，旋涡混合30 s，然后以16,100 g的离心力离心2 min。取400 µL上清液在40 ℃下氮气吹干。用75 µL 0.1%甲酸水溶液复溶后，在UPLC-MS/MS上分析。

液相色谱条件

系统：

ACQUITY UPLC I-Class (FTN)

进样针：

30 μL

色谱柱：

ACQUITY UPLC HSS PFP色谱柱

流动相A：

水

流动相B：

乙腈

进样针清洗溶剂：

80%甲醇水溶液+0.1%甲酸

清除溶剂：

流动相A

密封清洗液：

20%甲醇水溶液

柱温：

35 °C

进样体积：

20 μL

流速：

0.40 mL/min

运行时间：

3.0 min（进样之间间隔约 3.5 min）

梯度：

表1.色谱洗脱时间表

质谱条件

系统：

Xevo TQD

分辨率：

MS1 (0.7 FWHM) MS2 (0.7 FWHM)

采集模式：

多重反应监测(MRM)（详见表2）

极性：

ESI负离子模式

毛细管电压：

3.0 kV

离子源温度：

140 °C

脱溶剂气温度：

450 °C

驻留时间：

0.05 s（5-氟尿嘧啶），0.015 s（内标）

扫描间延迟时间：

0.02 s

通道间延迟时间：

0.01 s

数据管理

带TargetLynx应用管理软件的MassLynx软件4.1版

方法条件

表2.本研究中所用的5-氟尿嘧啶及其内标（5-氟尿嘧啶-13C15N2）的指导MRM参数。

结果与讨论

在上述色谱条件下，5-氟尿嘧啶与血浆中萃取出的同分异构干扰物（大约在1.1 min处洗脱）实现了分离。5-氟尿嘧啶的保留时间约为1.18 min。

图2. 5-FU (20 ng/mL)和血浆空白样的示例色谱图。

在分析5-氟尿嘧啶浓度高达10,000 ng/mL的血浆样品之后，未观察到系统残留。

分析灵敏度研究结果表明，该方法5-氟尿嘧啶的定量限为7.5 ng/mL（RSD < 20%，偏差< 15%）。 

精度评估试验设计为五天内每天萃取并定量分析四个不同浓度的QC样品（每个浓度五个重复样，n = 25）。研究中分析了各QC水平的五个重复样，以此评估方法的重复性。表3显示了四个浓度水平的5-氟尿嘧啶的总精度和重现性的RSD均小于9.0%。 

表3.5-氟尿嘧啶分析的总精度和重复性。

将高浓度和低浓度5-氟尿嘧啶混合样品按不同比例混合并进行分析，结果表明该方法在14~2600 ng/mL的范围内呈线性。

本研究评价了血浆中含有低浓度(40 ng/mL)和高浓度(1500 ng/mL)5-氟尿嘧啶时的基质效应(n = 6)。低浓度下的基质效应因子为0.62～0.69（平均值0.66），高浓度下的基质因子为0.46～0.75（平均为0.65）。使用同位素标记的5-氟尿嘧啶内标可补偿观察到的基质效应，得到低浓度和高浓度下的基质因子分别为0.94～0.98（平均值0.96）和0.96～1.05（平均值1.02）。

通过测定添加了高浓度的内源性化合物（白蛋白、胆红素、胆固醇、甘油三酸酯和尿酸）和外源性物质20%脂肪乳剂）的混合血浆样品中5-氟尿嘧啶高/低加标（40 ng/mL和1500 ng/mL）的回收率(n = 3)，评估了这些物质可能对分析造成的干扰。所得回收率范围为90.5%~110.6%。评估对乙酰氨基酚、氟康唑、5,6-二氢-5-氟尿嘧啶、酮康唑、伊曲康唑、甲氨蝶呤、苯妥英、泊沙康唑、尿嘧啶和伏立康唑对分析的干扰作用，得到回收率范围为91.8%～108.0%。导致回收率超出85%~115%范围的物质被视为干扰物。

血清外部质量保证样品（n = 6，范围100～2000 ng/mL）购自Asqualab（法国巴黎）。结果处于该方案的可接受范围内，平均偏差为2.6%。

结论

  • 本研究展示了一种为血浆5-氟尿嘧啶的分析开发的高灵敏度、高选择性的临床研究方法。
  • 此分析方法的样品前处理过程快速、经济，仅使用50 µL样品即可使低浓度的(20 ng/mL)5-氟尿嘧啶达到足够的分析灵敏度，并表现出优异的精度。
  • 实验证明该方法具有良好的线性，且未观察到系统残留污染。使用内标可充分补偿基质效应。
  • 此方法对于5-氟尿嘧啶的药代动力学和药效动力学研究具有重要的应用价值。

参考资料

  1. Fakih MG, Fetterly G, Egorin MJ, Muindi JR, Espinoza-Delgado I, Zwiebel JA, Litwin A, Holleran JL, Wang K and Diasio RB.A Phase I, Pharmacokinetic and Pharmacodynamic Study of Two Schedules of Vorinostat in Combination with 5-fluorouracil and Leucovorin in Patients with Refractory Solid Tumors.Clin Cancer Res.2010 Jul 15; 16(14):3786–94.

特色产品

720006049ZH，2017年7月

返回顶部 返回顶部