利用ACQUITY Arc系统和ACQUITY QDa质谱检测器分析牛奶和婴儿配方奶粉中的单糖和双糖

应用优势

• ACQUITY Arc™系统提供了两种流路选择，可模拟HPLC或UHPLC分离。
• 可实现葡萄糖和半乳糖这对难分离异构体的色谱分离。
• ACQUITY™ QDa™质谱检测器为常用于碳水化合物分析的示差折光(RI)或蒸发光散射(ELS)检测器提供了互补检测。

糖类和糖醇类均为碳水化合物，是食品中的天然成分，具有重要的营养价值。为了增加香味或模仿新鲜食品，人们会向加工后的食品中添加一些糖类。随着发达国家中日益增高的肥胖症和糖尿病患病率，近年来对于监控糖类摄入量的需求不断增加。因此，为了符合日益严苛的法规要求，需要在食品标签上提供准确的糖含量信息。

而这些化合物的分析极具挑战性，因为它们的化合物结构中缺少发色团，并且各种分子间十分相似，其中许多互为简单异构体。结构和分子式如图1所示。HPLC凭借其分离能力、准确度和分析速度，已经成为糖类分析的不二之选¹。HPLC技术通常采用RI或ELS检测。RI检测要求对流动相进行谨慎控制，避免在分析中发生任何变化，因此需要等度洗脱。采用RI检测时，难以在一次分析到下一次分析之间改变流动相组分，这是因为在使用不同的流动相组分时，RI检测器可能需要数小时才能达到平衡。在流动相组分发生变化的情况下，ELS检测相对而言更加可靠，但是ELS常常无法实现在复杂基质中检测糖类所需的灵敏度。

另一种能够发挥作用的方法是电喷雾电离(ESI)质谱检测。Waters™ ACQUITY QDa质谱检测器可降低检测限，并能够获取样品中各组分的质谱信息。色谱保留时间和质量信息的组合可提高糖类和糖醇类分析的选择性。ACQUITY QDa质谱检测器是唯一一款专为与LC系统结合使用而设计的质谱检测器。它可配置在LC仪器组合之中，所需空间与PDA检测器相同。已经熟悉HPLC的用户无需过多的培训，就能快速地利用质谱检测实现更佳的选择性和灵敏度。在本应用纪要中，介绍了将ACQUITY QDa质谱检测器与ACQUITY Arc系统相结合，用于分析牛奶和婴儿配方奶粉中的糖类。

样品制备

脱脂奶粉、乳制婴儿配方奶粉、大豆蛋白婴儿配方奶粉和低脂奶粉。根据Chavez-Servin等人2所述的步骤制备了上述样品，操作如下：

■ 将约0.6 g样品加入25 mL容量瓶中。

■ 加入10 mL乙腈-水(1:1)。

■ 在60 °C水浴中超声25 min。

■ 冷却，加入250 μL Carrez 1*试剂，搅拌1 min。

■ 加入250 μL Carrez 2**试剂，搅拌1 min。

■ 加入5 mL乙腈，混合。

■ 用乙醇-水(1:1)定容至25 mL。

■ 充分混合并转移到50 mL离心管中，使其沉淀。

■ 以2465g rcf离心30 min。

■ 使用0.2 μm PVDF滤膜过滤上清液。

■ *Carrez 1试剂：将0.36 g K4[Fe(CN6).3H20溶于10 mL水中。

■ **Carrez 2试剂：将0.72 g ZnSO4.7H2O溶于10 mL水中。

将上清液分别用1:1、1:500(用于分析蔗糖和乳糖)和1:20(用于分析果糖、葡萄糖、半乳糖和肌醇)的水:乙腈进行稀释。最终的定量计算中还应考虑25的初始稀释倍数。

图2展示了配备有ACQUITY QDa质谱检测器和PDA检测器的ACQUITY Arc系统。尽管图中展示了PDA，但是UV检测器不用于此次分析。图3显示了在本研究中使用的5 ppm水平(标准品5)下7种糖标准品的SIR色谱图。标注的m/z(215和377)代表[m+ Cl]-加合物的m/z。图4展示了分析物的质谱。向流动相中加入盐酸胍可使平衡向氯代加合物方向移动，单糖和肌醇为m/z215，双糖为377m/z。请注意，使用这种化学物质后，半乳糖和葡萄糖以及在麦芽糖和在其之前洗脱的乳糖均实现了基线分离。

图5显示了5 ppm的糖标准品(标准品5)以及乳制和大豆蛋白婴儿配方奶粉在m/z 215处的SIR色谱图。可以看到大豆蛋白配方奶粉中不存在半乳糖，这点与预期相同。两种配方奶粉中均含有肌醇，因为它是婴儿配方奶粉中的重要营养成分³。图6中突出显示了肌醇。

图7显示了5 ppm的糖标准品(标准品5)以及乳制和大豆蛋白婴儿配方奶粉在m/z 377处的SIR色谱图。从图中可以看出大豆蛋白配方奶粉中不含乳糖，但含有蔗糖和麦芽糖，而乳制婴儿配方奶粉中则不存在这两种糖。这也和预期相同，因为这两种糖来自植物，如未经过人工添加不应出现在乳制基质中。图8展示了分析物的校准曲线。所有分析物的回归系数(R²) > 0.998。

表1列出了所研究糖的定量值。乳制婴儿配方奶粉和大豆蛋白婴儿配方奶粉中的肌醇值通常与Indyk报道的值一致⁴。同样，乳制婴儿配方奶粉中的乳糖值通常与Ferreira报道的一致⁵。表2列出了大豆蛋白婴儿配方奶粉7次进样所得的重现性数据。RSD的重现性 < 0.25%，含量重现性则为8.20%。

由于混合了相似度很高的紫外透光性化合物，因此乳制品的碳水化合物分析极具挑战性。ACQUITY Arc系统、ACQUITY QDa质谱检测器和XBridge BEH Amide色谱柱的结合为科研人员带来了高性能、高分离度、灵敏度和高通量，并且相比为RI和ELS提供了分子量信息，实现了更多优势：

• 通过将保留时间和质量分析相结合，为化合物鉴定提供改善的分析选择性。
• 利用灵敏且选择性出色的检测器对紫外透光性分子进行检测。
• 实现半乳糖和葡萄糖这对难分离异构体的色谱分离。

1.IMPLVO Ferreira, et al.Determination of Sugars and Some Other Compounds in Infant Formula, Follow Up Milks and Human Milk by HPLC-UV/RI.37:(3) 225-229, 1998.

2.JL Chavez-Servin et al Analysis of Mono and Di-Saccarides in Milk Based Formulae by High Performance Liquid Chromatography with Refractive Index Detection.(2) 211-215, 2004.

3.HE Indyk and DC Woolard.Determination of Free Myo-Inositol in Milk and Infant Formula by High Performance Liquid Chromatography.Analyst.119:397-402, 1994.

4.Ibid p 401.

5.Ferreira, Op.Cit. p 227.