对血浆C-反应蛋白进行高灵敏度且可重现的LC-MS定量分析

本应用纪要介绍了一种采用通用试剂盒纯化方案的分析方法，该方法能够准确、可靠地定量血浆中内源性CRP的浓度。得益于LC-MS动态范围宽、专属性高的优势，低浓度内源性CRP以及患者体内可能存在的高浓度CRP都能实现可靠测定。

优势

实现蛋白质生物标志物的高灵敏度定量分析；采用基于通用试剂盒的方案进行蛋白质定量，分析速度快、重现性佳；Xevo TQ-XS质谱仪带来高灵敏度优势；应用混合模式SPE的样品制备方案具有高专属性，无需亲和纯化操作。

C-反应蛋白(CRP)¹在肝脏中天然合成，并作为炎症响应因子被释放到血液中。因此，通过测定CRP来诊断类风湿性关节炎(RA)^2,4等慢性炎症以及评估心血管疾病风险³和炎性癌变过程⁴的方法受到广泛关注。组织损伤或炎症会使血浆CRP浓度升高100倍以上²。健康个体的内源性血浆CRP浓度相对较低，一般为0.1～3 µg/mL (4～120 nM)²，但患者体内的CRP浓度却高出许多，要实现准确定量，需要使用多重ELISA或比浊免疫法³。由于需要进行多重测试，样品浓度范围往往会超出配体结合试验(LBA)方法的线性动态范围。除了这一固有劣势之外，还有很多其它原因促使业界逐渐转向采用LC-MS方法，例如缺乏标准化方法、可能发生交叉反应、成本高昂、难以保证试剂配制的一致性等等，而这些只是众多原因中的一小部分。质谱检测在蛋白质定量方面拥有诸多优势，如灵敏度高、专属性高、线性动态范围宽、方法开发速度快以及可进行多重分析等。不过，蛋白质的LC-MS定量方法仍然面临许多难题。目前这种方法还没有形成一套标准化的工作流程，而现有的各种工作流程往往复杂又繁琐，使得科学家们难以成功完成分析。本应用纪要介绍了一种通用试剂盒方案，相较于文献中耗时长达24 h的标准方法⁵，该方法仅需2 h即可完成酶解。酶解和后续的肽纯化步骤采用ProteinWorks eXpress直接酶解试剂盒（部件号：176003688）和ProteinWorks µelution SPE净化试剂盒（部件号186008304）完成，以准确、可靠地定量人血浆中的内源性CRP。采用上述试剂盒及其随附的方案，我们仅使用35 µL血浆样品就达到了0.025～0.1 µg/mL (1～4 nM)的LLOQ。

向大鼠或人血浆中加标0.025～100 µg/mL (1～3987 nM)范围内的不同浓度CRP（人序列），以制备校准曲线标准品和质量控制(QC)样品。CRP QC样品为1批次大鼠血浆和4批次人血浆制备。每个浓度的校准曲线标准品重复制备两份，每个QC浓度的QC样品重复制备三份，空白（不加标）血浆样品则重复制备四份。使用ProteinWorks eXpress直接酶解试剂盒并专门按照试剂盒随附的3步方法（无需还原/烷基化步骤）酶解血浆样品(35 µL) 2 h，变性时间则缩短为5 min（部件号：176003688）。酶解之后，使用ProteinWorks µElution SPE净化试剂盒（部件号：186008304）以及随附的方案纯化特征性肽段。

尽早检出浓度升高的CRP对于RA或心脏病的正确治疗和预防至关重要。  能够检出低浓度CRP并区分其微小浓度差异的高灵敏度分析方法将有助于CRP的早期检出。质谱检测法虽然并非CRP定量的传统方法，但该方法拥有足够的灵敏度和重现性，能够准确测定健康个体的低浓度内源性CRP以及患病群体的高浓度CRP。

质谱分析

蛋白质的LC-MS定量分析方法通常采用“自下而上”方案，即首先对蛋白质进行酶解（一般使用胰蛋白酶），然后分析酶解所得的肽（胰蛋白酶肽）。为了确定合适的人CRP（图1）代表性或特征性肽段，我们使用Skyline软件（华盛顿大学MacCoss实验室）进行了模拟酶解⁶。除了能确定可能生成的胰蛋白酶肽之外，Skyline还能选择和优化用于MRM（多重反应监测）分析的母离子和碰撞诱导解离碎片离子，从而协助MS方法开发。图2所示为CRP的完整氨基酸序列⁷及其独有的特征性肽段：AFVPFK、ESDTSYVSLK和GYSIFSYATK（以蓝色突出显示）。经过优化的CRP胰蛋白酶肽MS分析条件和MRM通道列于表1。每种肽均设有初级和确证（次级）通道。

在一项早期研究中，我们使用Xevo TQ-S MS对CRP进行了定量分析。本研究将此定量方法转移到了灵敏度更高的新一代平台：Xevo TQ-XS三重四极杆质谱仪。与之前的平台相比，使用Xevo TQ-XS分析三种定量用CRP肽的信噪比(S/N)分别提升了2.5倍(AFV)、3.5倍(ESD)和1.4倍(GYS)。AFV肽检测灵敏度的提升如图3所示。对于ESD肽(RT 3.63 min)，表现为主峰肩峰的干扰基质峰(RT 3.72 min)强度降低了7倍，如图4所示。基质干扰的降低有利于峰积分和优化检测限。

色谱分离

由于胰蛋白酶肽分子小且极性强，其在反相色谱柱上的保留性较差。本研究使用ACQUITY HSS T3, 1.8 µm, 2.1 x 50 mm色谱柱（部件号：186003538）分离CRP肽，相较于BEH C₁₈色谱柱，这款色谱柱更经济，对胰蛋白酶肽的保留性更强，还有助于提高目标肽与内源性基质干扰峰之间的分离度。三种肽（AFVPFK、ESDTSYVSLK和GYSIFSYATK）的代表性色谱图如图5所示。峰宽均< 4.5 s。

样品制备

蛋白质定量分析的常规样品制备工作流程通常较为复杂和繁琐。本研究使用ProteinWorks eXpress直接酶解试剂盒（部件号：176003688）直接酶解血浆样品，仅需2 h即可完成酶解。酶解之后，使用ProteinWorks µElution SPE净化试剂盒（部件号：186008304）及随附的方案去除缓冲盐、磷脂和过量的酶解试剂。SPE试剂盒采用混合模式吸附剂（Oasis MCX，反相和离子交换吸附剂），专属性极高。胰蛋白酶肽将结合至SPE吸附剂的离子交换区域，因此可从整体上赋予方法正交性并提升其专属性。此外，相较于仅含传统反相填料的吸附剂，离子交换吸附剂能够更高效地保留强极性肽。这一点对于成功保留极性最强的ESD肽尤为重要。使用本文所述的通用方案，全部三种CRP肽的回收率都非常出色（回收率≥ 90%）。

线性、精度和准确度

仅使用35 µL样品和前文所述的ProteinWorks试剂盒，大鼠和人血浆中CRP的定量限分别达到了0.025和0.05 µg/mL (1～2 nM)。大鼠和人血浆中胰蛋白酶肽的校准曲线均呈线性（R²值>　0.99，使用1/x或1/x²加权回归）。大鼠和人血浆的标准曲线性能汇总如表2和表3所示。线性、准确度和精度均符合典型的方法验证要求。大鼠和人血浆的标准曲线在4个数量级范围内均呈线性，而且平均准确度达94%～105%。所有QC样品的精度和准确度都非常出色，平均%RSD均小于5%，并且QC准确度(%)达94.3～106.2（大鼠血浆）和89.4～103.5（人血浆）。表4展示了大鼠血浆QC样品检测结果的统计数据。人血浆QC样品中AFV和ESD肽检测结果的统计数据分别如表5的A表和B表所示。上述检测结果对应的色谱图如图6中的A图和B图所示。

4批次人血浆中内源性人CRP的浓度均得到了准确定量。在高于人血浆内源性浓度的情况下，可精准定量的CRP最低浓度为0.05 µg/mL (2 nM)。在空白人血浆酶解物的色谱图中（图6），由于内源性CRP浓度可达0.4～0.666 µg/mL，因此存在较强的人CRP肽信号。大鼠空白血浆酶解物中（图4）未检出人CRP肽，这一点符合预期，因为大鼠CRP的氨基酸序列与人CRP序列不同。4批次人血浆中内源性CRP的浓度计算结果汇总于表6中，对应的色谱图如图7中的A图（AFV肽）和B图（ESD肽）所示。对于各批次的血浆，根据胰蛋白酶肽AFV或ESD计算得到的内源性CRP浓度一致（相差不超过10%）。采用各种肽的确证通道验证了每批次血浆样品的内源性浓度。  除批次1之外，根据初级和确证通道计算所得的浓度之间的偏差都不超过10%。根据GYS肽计算出的内源性CRP浓度与根据AFV和ESD肽计算出的结果不吻合。推测其原因可能是潜在共洗脱干扰物影响了基于GYS肽结果进行定量的准确性。

本研究使用市售酶解和纯化试剂盒对浓度低至0.025 µg/mL (1 nM)的内源性CRP进行了可靠定量。采用试剂盒随附的方案对血浆样品(35 µL)进行直接酶解（无需亲和纯化步骤）并完成了后续的胰蛋白酶肽纯化。将混合模式SPE与上述方案配合使用，三种肽的回收率都达到90%以上。包括SPE在内的总样品制备时间不超过3 h。将Xevo TQ-S MS平台升级为Xevo TQ-XS提高了分析灵敏度和信噪比，进而改善了LOQ。实验结果表明，这种采用通用试剂盒纯化方案的分析方法可准确、可靠地定量血浆中的内源性CRP浓度。得益于LC-MS动态范围宽、专属性高的优势，低浓度内源性CRP以及患者体内可能存在的高浓度CRP都能实现可靠测定。 

1. C-reactive protein, pentameric structure In Wikipedia.Retreived 19Sep2016 from https://commons.wikimedia.org/w/index.php?curid=6003861
2. Kun, E., Wu, J., Karl, J., Liao, H., Zolg, W., Guild, B. (2004) Quantification of c-reactive protein in the serum of patients with rheumatoid arthritis using multiple reaction monitoring mass spectrometry and 13C-labeled peptide standards.Proteomics (Issue 4), pages 1175–1186. 
3. C-reactive protein test (2014, 12 Dec.)Retreived from http://www.mayoclinic.org/tests-procedures/c-reactive-protein/basics/definition/PRC-20014480
4. Allin.K.H., Nordestgaard, B.G., (2011) Elevated c- reactive protein in the diagnosis, prognosis, and cause of cancer.Critical reviews in clinical laboratory sciences.Volume 48 (Issue 4), pages 155–170.
5. Rezelia, M., Végvária, A., Silajdžićb E., et.al.(2014) Inflammatory markers in Huntington’s disease plasma-A robust nanoLC-MRM-MS assay development.EuPA Open Proteomics (3) pages 68–75.
6. Skyline targeted mass spec environment (2016).Downloaded March 2016 from https://skyline.gs.washington.edu/labkey/project/home/software/Skyline/begin.view
7. UniPro, (16May2014).UniProtKB – P02741 (CRP_Human).Primary accession number: P02741.Retreived from http://www.uniprot.org uniprot/P02741