使用基于UNIFI的沃特世法医毒理学应用解决方案筛查大麻素

本应用纪要展示了利用UNIFI扩展法医毒理学应用解决方案的灵敏度和选择性，在负离子模式下提供了一种一致、全面的大麻素类物质测定方法。该方法既可用来筛查特定大麻素，也可用来定量这些分析物，使用简单的五倍稀释即可检测到分析浓度低于现行EWDTS尿液筛查cut-off值（大麻代谢物为50 ng/mL）的大麻素。自动生成的简单标准曲线图展示了该系统出色的线性动态范围。

优势

基于UNIFI的法医毒理学应用扩展解决方案，能够检测和定量尿液中的负离子化的大麻素。

大麻是全球使用相当广泛的一种违禁物质，长期使用可能成瘾。大麻素是最常检出的非法药物之一，因此大麻素的分析对于法医检测和工作场所检测而言极其重要。Δ-9四氢大麻酚(THC)和大麻酚(CBN)是大麻植株中存在的精神活性成分¹。THC可产生一系列代谢物，例如11-去甲-9-羟基-Δ9四氢大麻酚(THC-OH)，但对于尿液药物检测而言，最重要的代谢物是11-去甲-9-羧基-Δ9四氢大麻酚(cTHC)，它是通过尿液排出的主要代谢物，以游离酸或酯联β-葡糖苷酸的形式存在²。大麻二酚(CBD)是大麻树脂的主要成分，但它的精神活性被认为是有限的。

沃特世基于UNIFI的法医毒理学应用解决方案目前包括使用正交加速飞行时间质谱仪（在电喷雾电离的正离子模式(ESI+)下运行）采集精确质量数MS^E数据，然后将数据与包含1000多种毒理学相关物质的综合数据库进行比对^3,4,5。许多化合物（如大麻素）也会在电喷雾电离的负离子模式(ESI-)下电离，因此，我们近期的工作重点便是进一步扩展法医毒理学应用解决方案，使其适用于上述化合物。我们使用新方法测定尿液中是否存在大麻素，尤其是在大麻素浓度低于当前筛查cut-off值⁶的情况下，并将使用该方法获得的数值与使用最近发布、经过充分验证的UPLC-MS/MS分析方法获得的数值进行比较⁷。

材料

THC、CBD、CBN、THC-OH和cTHC (1 mg/mL)参比标准品购自LGC Standards（英国特丁顿）；cTHC-葡糖苷酸和cTHC的氘代(d-3)类似物（用作内标；ISTD）购自同一供应商，浓度为0.1 mg/mL。

使用前先用乙腈将各个标准品稀释至5000 ng/mL，用0.001%甲酸溶液将内标稀释至100 ng/mL。

Bio-Rad正常对照尿液以及Bio-Rad Liquichek Urine Toxicology Controls C2和S10水平参比尿液购自Bio-Rad Laboratories（英国赫默尔亨普斯特德）。

使用的所有其他化学品均为最高级别，并根据供应商的说明进行储存。 

标准样制备

将标准品(0.1 mL)加入盛有0.9 mL 0.001%甲酸溶液的最大回收样品瓶中，涡旋混合，得到浓度为500 ng/mL的标准样溶液。

样品前处理

将乙腈(0.1 mL)加入0.2 mL尿液和ISTD (0.7 mL)中。将样品在1200 rpm转速下涡旋混合5 min，然后在8000 g下离心10 min。将上清液转移至最大回收样品瓶中。

本次分析中研究的大麻素列于表1中，其中包括精确中性质量数、高能碎片离子和UPLC保留时间。

每种分析物阳性鉴定的可接受标准如下：三维(3D)低能量离子计数强度大于250，保留时间与参比值偏差在0.35 min以内，且实测母离子质量数与预期值的偏差在5 ppm以内。为了进一步确认，还必须在高能量功能通道中发现至少一种诊断碎片离子。图1显示了浓度为100 ng/mL的大麻素标准样（cTHC-葡糖苷酸为50 ng/mL，大麻酚为500 ng/mL）的色谱分离结果。

为了研究线性，我们按上述方法，在Bio-Rad对照尿液样品中加标cTHC和cTHC葡糖苷酸，浓度范围为0~500 ng/mL（cTHC-葡糖苷酸为250 ng/mL），制备了两份样品。在处理过程中，每条阳性鉴定分析物迹线的3D峰响应会自动生成，并作为ISTD响应的参考；使用1/x加权绘制标准曲线，并对两种分析物进行线性拟合。两种分析物的相关系数（r²值）均≥0.995；cTHC的标准曲线如图2所示。根据上述详细标准，cTHC-葡糖苷酸阳性鉴定结果的最低标准曲线浓度为6.25 ng/mL，cTHC为12.5 ng/mL。

真实尿液样品分析：对26份真实尿液样品和两种市售参比尿液（Bio-Rad Liquichek C2和S10水平）进行了分析，分析方法遵循了本文中描述的样品前处理方法。这些真实样品为匿名样品，之前已使用经过充分验证的UPLC-MS/MS方法进行了定量分析⁷。表2显示了26份真实样品的UPLC-MS/MS结果，以及UPLC-QTof-MS^E的分析结果，表中展示了按照前述标准cTHC或cTHC-葡糖苷酸是否存在（阳性鉴定）。

UPLC-QTof-MS^E方法成功鉴定出11个样品中的cTHC和16个样品中的cTHC-葡糖苷酸，并且与UPLC-MS/MS数据的总体一致性很好（表3）。这表明，即使cTHC浓度低于欧洲工作场所药物检测协会(EWDTS)规定的筛查cut-off值50 ng/mL，仍然可以使用该方法一致地检测尿液中的cTHC和cTHC-葡糖苷酸，使用简单的五倍稀释即可⁶。

此外，该方法还检测出了两种市售参比尿液样品中的cTHC，并进行了正确鉴定。使用这种方法分析Bio-Rad Liquichek C2和S10水平参比尿液样品获得的半定量结果与制造商提供的参考值相符，结果如表4所示。图3所示为Bio-Rad Liquichek S10水平参比尿液中存在的4个cTHC高能碎片离子的相关信息，进一步证实了结果。

本应用纪要展示了利用UNIFI扩展法医毒理学应用解决方案的灵敏度和选择性，在负离子模式下提供了一种一致、全面的大麻素类物质测定方法。该方法既可用来筛查特定大麻素，也可用来定量这些分析物，使用简单的五倍稀释即可检测到分析浓度低于现行EWDTS尿液筛查cut-off值（大麻代谢物为50 ng/mL）的大麻素。自动生成的简单标准曲线图展示了该系统出色的线性动态范围。 

致谢

感谢CEDAM Italia（意大利布雷索）和Bianalisi Analisi Mediche（意大利卡拉泰布里安扎）提供的匿名真实尿液样品。 

1. Dewey WL.Cannabinoid Pharmacology.Pharmacol Rev. 1986 Jun;38(2):151–78.
2. Pallente S, et al.Synthesis and Characterization of Glucuronides of 5’-Hydroxy-delta-9-THC and 11-Hydroxydelta- THC.Drug Metab Dispos.1978 Jul Aug;6(4):389–95.
3. Wood M. MS^E在毒物筛查中的实用性.沃特世技术简报.2010. P/N 720005198ZH.
4. 法医毒物筛查.沃特世产品手册.2013. P/N 720004830ZH.
5. Roberts M和Wood M. 使用UPLC结合精确质量数筛查分析β-受体阻滞剂.沃特世应用纪要.2014. P/N 720005188ZH.
6. European Workplace Drug Testing Society guidelines. http://www.ewdts.org (于2015年5月5日访问).
7. Lee R and Wood M. Using UPLC-MS/MS for Workplace Drug Testing.沃特世应用纪要.2014. P/N 720005032EN.

实验室在应用本方法之前，用户有必要对方法进行一次完整的验证。