• 应用纪要

使用UPLC精确质量数筛查分析β-受体阻滞剂

使用UPLC精确质量数筛查分析β-受体阻滞剂
  • Mark Roberts
  • Michelle Wood
  • Waters Corporation
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Beta blocker drug for heart and blood vessels

仅适用于法医毒理学应用。

摘要

本应用纪要展示了法医毒理学应用解决方案搭配UNIFI软件在人类尿液中对低浓度β-受体阻滞剂进行筛查时的灵敏度和选择性，可实现极小样品制备量下的全面筛查，并达到MRPL。 

优势

  • 帮助分析人员可靠地筛查和鉴定尿液中的β-受体阻滞剂药物
  • 系统自动处理数据，并通过完全自定义的工作流程和报告呈现给用户。

简介

普萘洛尔是首个在临床上成功应用的β-受体阻滞剂。它在20世纪60年代早期由JW Black合成1，对控制心绞痛的治疗产生了革命性影响，并且促进了更多β-受体阻滞剂的开发。β-受体阻滞剂可竞争性地阻断β肾上腺素能激动剂在心肌细胞及交感神经系统其他组织中β受体处的作用。β-受体阻滞剂可合法地处方和使用，主要用于控制高血压、心绞痛和心律失常。然而，这些物质可能会被想要降低心率、降低血压或改进精细运动技能的运动员滥用。因此，世界反兴奋剂组织(WADA)将β-受体阻滞剂列入了2014年的禁用清单2(P2类)，限制了在箭术、高尔夫和射击等运动中此类药物的使用。

近年来，液相色谱和质谱技术的革新，为鉴定尿液样本中的β-受体阻滞剂提供了支持。

实验

样品前处理

制备含以下β-受体阻滞剂的甲醇混合标准品，浓度为50 µg/mL：醋丁洛尔、阿普洛尔、阿替洛尔、布诺洛尔、比索洛尔、卡拉洛尔、塞利洛尔、左布诺洛尔、美替洛尔、美托洛尔、纳多洛尔、奈比洛尔、氧烯洛尔、吲哚洛尔、索他洛尔和噻吗洛尔。用混合标准品加标空白人体尿液，最终浓度为50、100*、250和500 ng/mL。将流动相A简单稀释5倍，用于制备进样用的各个加标尿液样品。

* WADA认证实验室的最低性能水平要求(MRPL)。

方法条件

液相色谱条件

液相色谱系统：

ACQUITY UPLC I-Class (FTN)

运行时间：

15 min

色谱柱：

ACQUITY UPLC HSS C18 2.1 × 150 mm, 1.8 μm

样品瓶：

沃特世最大回收样品瓶

柱温：

50 °C

样品温度：

10 °C

进样体积：

10 μL

流速：

0.4 mL/min

流动相A：

5 mM甲酸铵水溶液，pH调节至3.0

流动相B：

0.1%甲酸的乙腈溶液

梯度：

在10 min内流动相A从87%降至50%，降至5%流动相A并在回升至87%之前保持1.5 min

MSE条件

质谱系统：

Xevo G2-S QTof

电离模式：

ESI+

离子源温度：

150 °C

脱溶剂气温度：

400 °C

脱溶剂气流速：

800 L/h

参比质量数：

亮氨酸脑啡肽，[M+H]+ = 556.2766

采集范围：

m/z 50~1000

扫描时间：

0.1 s

毛细管电压：

0.8 kV

锥孔电压：

25 V

碰撞能量：

功能通道1：6 eV

功能通道2：从10 eV升至40 eV

结果与讨论

进样稀释的加标尿液样品，使用基于MSE的标准法医毒物筛查采集数据3,4。随后使用含有1,000多种毒理学相关物质的UNIFI法医毒理学谱库处理数据。结合质量数准确度、保留时间(RT)和预期碎片离子的存/无获得定性鉴定结果。在相同的处理步骤中，UNIFI科学信息系统还能生成和显示各个定量数据。

UNIFI使用简单的工作流程方法指导用户获得样品结果；根据鉴定结果的可靠程度自动筛选数据并呈现给用户，从而减少了分析人员的审查需求。工作流程可完全自定义 - 图1展示了可能会用到的标准的示例。 

在本研究的最低浓度下(50 ng/mL)所有β-受体阻滞剂均成功鉴定，且符合用户定义的“阳性”药物结果标准。图1至图4提供了一些可自动显示或用户可在“审查”窗格中通过“单击”访问的数据的说明性示例。

基于两种不同鉴定类别的工作流程示例
图1.基于两种不同鉴定类别（“阳性”和“暂定”）的工作流程示例以及两种鉴定类别各自所使用标准的汇总。

相较于只能为检测到的组分提供极其简单图形显示的视图，选择“组分概要”（图2）可查看每个鉴定结果的全部信息。这种用户友好的表格汇总了鉴定峰的关键特性，包括质量精度、确证碎片离子和同位素信息（在本例中，只展示了与“阳性”标准匹配的组分）。 

如有需要，也可显示特定组分的母离子和全部高碰撞能量碎片离子的提取质量色谱图，如“色谱图”窗口所示（图2左下方）。

如“谱图”窗口所示，查看组分的低能量和高能量谱图可获得更多信息。此视图突出显示了上方迹线中的母离子和下方迹线中发现的碎片离子。UNIFI集成了ApexTrack算法，可改进三维(3D)色谱峰检测，有助于生成更清晰的质谱，让碎片离子与谱库更好地匹配。 

除了查看谱图外，它还常用于显示确证碎片离子数据的汇总结果。图2还展示了“碎片离子”表格，其中包含醋丁洛尔预期碎片离子的详细信息、检测到的每个碎片离子相关的质量数误差以及检测到的碎片离子强度。

50 ng/mL加标尿液样品的详细信息
图2.50 ng/mL加标尿液样品的详细信息。“组分概要”展示了前五种分析物（按字母排序）的详细信息。F v E (%)列显示了实际碎片离子与预期碎片离子的比值，以百分比表示。“同位素匹配强度RMS百分比”与“同位素匹配Mz RMS PPM”表示母离子簇的理论同位素分布与观察到的同位素分布的匹配程度。色谱图窗口包含所选母离子的提取质量色谱图，即醋丁洛尔(m/z 337.212)和碎片离子（m/z 116、319、98和260）。“谱图”窗口显示了醋丁洛尔的低碰撞能量（上图）和高碰撞能量（下图），“碎片”表格显示了醋丁洛尔的各个预期碎片离子。

获得的每个组分的同位素分布也能够辅助鉴定。图3显示了一种含硫化合物索他洛尔的低碰撞能量迹线谱图。硫的两种含量最高的稳定同位素为32S和34S，其比率为95:4。UNIFI中的算法可用来表示组分的理论同位素分布与观测到同位素分布的匹配程度，得分越低，表明匹配度越好。“同位素匹配强度RMS百分比”这列可作为一个额外的确认点添加到“组分汇总”表中。通过进一步的UNIFI算法评估每个同位素峰的预期m/z与实际m/z的一致性水平，结果如“同位素匹配Mz RMS PPM”中所示，同样，得分越低表明匹配度越好，如图2“组分概要”窗口最右侧列中所示。

索他洛尔的低碰撞能量谱图
图3.索他洛尔的低碰撞能量谱图，显示了对应于硫同位素32S和34S的m/z 273离子和m/z 275离子。UNIFI包含的算法可自动比较指定物质所测组分与理论组分的同位素数据；此数据列在“组分概要”表的最后两列。

图4中特别展示了使用每种β-受体阻滞剂在各种浓度下（50、100、250和500 ng/mL）三次重复进样所得的数据绘制的半定量标准曲线图。标准曲线由每种分析物的响应值计算所得，该数值来自单同位素母离子峰的3D积分。由于本研究中未使用内标，因此这些半定量数据仅展示了仪器的典型动态范围。 

四种β-受体阻滞剂分析物的标准曲线
图4.加标到尿液中的四种β-受体阻滞剂分析物（加标浓度为50、100、250和500 ng/mL）采用非加权线性拟合所得的标准曲线图（三次重复进样）。

图5展示了UNIFI软件从结果中生成的完全自定义报告，此结果为本样品鉴定提供了重要的详细信息。图5展示了报告的一部分，其中包含每个鉴定类别的“组分图”和“组分概要”表。

完全自定义的报告
图5.完全自定义的报告，展示了本次进样的“组分图”和“组分概要”表的前两列。

结论

本应用纪要展示了法医毒理学应用解决方案搭配UNIFI软件在人类尿液中对低浓度β-受体阻滞剂进行筛查时的灵敏度和选择性，可实现极小样品制备量下的全面筛查，并达到MRPL。尽管精确质量数MSE数据具有复杂的特性，但UNIFI软件仍可利用它实现用户友好的全面数据分析、解析和报告。自动生成的四个简单的标准曲线图展示了本系统出色的线性动态范围。

参考资料

  1. Black JW, Crowther AF, Shanks RG, Smith LH, and Dornhurst AC.A new adrenergic beta-receptor antagonist.Lancet.1964 May 16;1(7342):1080–1.
  2. The World Anti-Doping Code: The 2014 Prohibited List, International Standard.http://list.wada-ama.org/wp-content/uploads/2013/11/2014-Prohibited-List-ENGLISH-FINAL.pdf (accessed 20 September 2014).
  3. Rosano TG, Wood M, Ihenetu K, and Swift TA.Drug screening in medical examiner casework by high resolution mass spectrometry (UPLC-MSE-TOF).J Anal Toxicol.2013 Oct;37(8):580–93.doi: 10.1093/jat/bkt071.
  4. 法医毒物筛查.沃特世产品手册，720004830ZH.

特色产品

720005188ZH，2014年9月

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