使用什么类型的仪器?

在质谱分析中,对实验控制力是尤其重要的。一旦在周密的控制条件下得到离子,必须以适合的灵敏度将每个离子作为离散事件实施检测。极少量的气体载量使GC成为联用技术早期理想的选择,但仅仅适合20%的化合物分析。现今,我们在大多数情况下雾化LC洗脱液,将其作为质谱仪中导入被测物实施电离的方法,该技术要求确保真空环境。

任何质谱仪的一个重要设计元素是泵的容量。真空必须完全分布到仪器的所有稀薄大气区域,并且泵容量必须充足,以满足设计上的要求,比如离子入口的大小和需要去除蒸汽的量。

分析器:质谱仪的心脏

分析器是分离或区分导入离子的仪器。在离子源可以形成正负离子,以及不带电的中性粒子。但是,在指定时刻仅能记录一种极性。现代的质谱仪能够在毫秒间转换极性,得到高保真记录,即使快速短暂事件,如典型的UPLC或GC分离中,峰仅仅大约1秒宽。

四极杆和扇形磁场

在1953年,西德物理科学家Wolfgang Paul和Helmut Steinwedel描述了四极杆质谱仪。在4根平行杆之间,叠加的射频(RF)和恒定的直流(DC)电势能够作为质谱分离器,或过滤器,仅限于特点质量范围的离子,以恒定振幅振荡,能够在分析器上收集。现代仪器制造商将四极杆瞄准到特定的应用中。单四极杆质谱仪要求基质干净,以避免无用离子的干扰,表现出非常好的灵敏度。

三重四极杆,或串联四极杆(参见四极杆),是将一个四极杆加到另一个附加的四极杆上,四级杆串联后能以各种方式发挥作用。一种途径是通过离子独有的质荷比(m/z)分离并检测复杂混合物中的目标离子。证实串联四极杆有效的另一途径是当与可控裂解分析联用时。这些分析通常将目标离子与其它分子(典型的气体,如氩)进行碰撞,母离子裂解成产物离子,MS/MS质谱仪通过其独特组成部分鉴别目标化合物。

图 6:当设置过滤某一特定离子,那么其它质量的离子则会以多种方式中丢失,比如撞击到四极杆上,或直接偏离去检测器的轨道。四级杆分析器由四根杆组成,通常平行排列,材质为金属,比如钼合金。已投入

了大量的技术和研究,设计开发四极杆。按照离子在DC和RF场中的运动,将质量分类。通过在软件上改变参数,系统可改变场强,在任何指定时间内,某一m/z值的离子被过滤掉,或通过四级杆到达检测器。相比于一些质谱仪的设计,比如飞行时间TOF质谱仪(Tof),四极杆分辨率较低。而四极杆相对简单,容易使用,是具有较高实用性的质谱仪,能以相对低的成本提供各种接口。

在比较和说明MS的分析能力时,一些专业用语是必需的,在该入门指南的后续内容中将会给出完整的定义:

分辨力(通常缩写为"res"-质谱仪分离两种质量的能力):
- 低分辨力=单位质量=1000
- 较高或中等分辨力=1000到10000
- 高分辨力=10000+
- 非常高的分辨力=高达3-5百万Fragmentation

更详细的分辨率检查和我们怎样测定分辨率将在"质谱准确性和分辨率"章节说明。"精确质量"(Exact Mass)是化合物质量的理论值,而准确质量(Accurate Mass)是化合物质量的测量值,有相关的误差范围,比如5ppm。准确质量也经常用于针对具体的技术,而不是测得的质量。MS/MS - 描述了监测前体离子或碎片向产物离子转变的多种实验(多反应监测[MRM]和单反应监测[SRM]),总的趋势是在一台仪器上提高检测的选择性、专一性或灵敏度。即前后两个质量分析器,两极质谱分析在一台质谱仪器中实现。在三重四级杆质谱仪中有3套四级杆过滤器,但是仅有第1和第3套四极杆用作质量分析器。近来的设计完全将中间设备区分开(取代早期设计的四极杆),增加了更多的功能,通常将其改称为串联四极杆。第一套四极杆(Q1),作为质量过滤器,传输并加速选定离子,将其送向Q2(被称为碰撞室)。虽然在一些设计中,Q2类似于其它两套四极杆,RF施加在杆上的作用仅是传输,而不是质量选择。Q2中的压力较高,离子在碰撞室内与中性气体相碰撞。结果经CID发生裂解。碎片随后加速进入Q3,另一个质量过滤器,离子被排列后,进入检测器。

裂解CID也称为碰撞激活解离(CAD),为一种裂解机制,通过该机制在气相中,分子离子裂解,通常在真空区域经电势加速到高动能,接着与中性气体分子碰撞,比如氦、氮或氩。部分动能通过碰撞而转化(或内化),这引起化学键的断裂,分子离子减小形成较小的碎片。一些类似的‘特别目的'的裂解方法,包括电子转移解离(ETD)和电子捕获解离(ECD)。

图 7:硫丹-β产物离子质谱图。237Da的前体离子从左边进入,在MS/MS碰撞室内裂解。关于MS谱的全扫描,数据系统仅能够显示目标碎片(不是得到的所有碎片),得到相对简单的图谱。您能控制破碎的限度,因此您能选择前体离子。

图 8:MRM响应(左)和SIR响应(右)的比较图表明,由于基质的化学背景,被测物即使在溶液中,也不能由SIR数据确定被测物峰。使用相同的GC/MS/MS质谱仪,选择m/z=146的丁基化离子作为前体离子,裂解该离子,得到产物离子(显示为57m/z),定量鉴别它的存在。在一些控制工业中,为了满足阳性化合物的鉴别要求,每个MRM计为1.5"鉴别点",而每个SIR计为1.0。因此,为满足选择性要求,得到3"IPS",每个化合物您需要2个MRM转换,或3个SIR。扇形磁场,或扇形磁场质量分析器,是早期仪器,一直用到现今,尽管用的较少(已被现代的能以ESI电离模式工作的质谱仪取代,)。例如,Waters AutoSpecTM,广泛用于极端高灵敏度的二英分析。

扇形磁场弯曲成弧形离子轨道。离子的"动能与电荷"比率决定了轨道的半径,可通过电或磁场测定。较大m/z的离子比较小m/z通过的轨道路径长。通过改变磁场强度,可控制轨道路径。双聚焦质谱仪可按各种组合方式,将磁场和电场结合起来,但扇形电场后接磁场更常见。两种场最初联用时,按照离子流出离子源的动能采用扇形电场聚焦离子。角度聚焦之前的能量聚焦,使相同质量,但分子式不同的离子实现分离。离子阱和其它非扫描质谱仪离子阱质谱仪的原理类似于四极杆质谱仪。不同于过滤式的四极杆质谱仪,离子阱和功能更强的离子回旋(ICR)质谱仪一样,将离子存储在三维空间中。在饱和之前,离子阱或回旋加速器将选定离子射出以进行检测。在离子阱范围内,可实现一系列实验分析,裂解目标离子,通过形成的碎片,以准确的确定前体离子。RF电压产生的电场作用于排列成"三明治"几何构形(端盖相对的端盖电极)离子阱的两电极之间的空间。扫描RF电压,改变某离子的固有频率使其逸出。有时动态范围不宽。离子阱对捕获存储离子的有限体积和容量,限制了该种质谱的使用范围,尤其对于复杂基质中的样品。离子阱质谱仪于1980年推出,但是早期这类质谱仪采用内部电离,具有一定的局限性,限制了其在很多领域的应用。仅当出现外部电离技术后,这类质谱仪才得到了越来越广泛的使用。多级碎裂的能力,从一个被测物中可衍生出更多结构信息(即,碎裂-碎片离子-选择-特定片段-碎裂,并重复这一过程)被称为MSn。GC色谱峰不够宽,不允超过一个碎裂过程的进行(MS/MS或MS2)。离子阱质谱仪的MS/MS分析或裂解是根据时间,而不是空间,与四极杆和扇形磁场相同。因此,离子阱不能用于某些MS/MS分析,比如中性丢失和前体离子的比较。而且,在离子阱质谱仪的MS/MS图谱中,低质量端约1/3母离子m/z的碎片离子丢失,这是离子阱设计本身造成的结果。为了抵消这一损失,一些制造商通过软件加宽扫描要求弥补了这一损失。加宽扫描要求在数据采集时转换工作参数。

离子阱的设计设置了前体质荷比(m/z)和最低俘获碎片离子之间的比率上限,通常称为"三分之一规则"。例如,一个m/z1500的母离子,其m/z500以下的碎片离子检测不到,这大大限制了多肽的人工测序分析。当太多离子进入离子阱的空间,由于空间电荷效应,动态范围受到限制。制造商已经开发了自动扫描技术,在离子进入离子阱之前,能够对离子进行计数,或门控制允许离子进入的数量。在大量背景离子共存目标离子很少时,仍然会遇到困难。因为功能设计类似,杂交型串联质谱仪吸收了四极杆和离子阱两方面的长处,提高了灵敏度,并可以进行快速实验分析,实现两种质谱仪单独使用不能实现的功能。这种质谱仪有时称为线性离子肼(或Q-TRAPs)。线性离子阱质谱仪离子阱体积的增加(与三维离子阱相比),提高了动态的范围。离子阱质谱仪不能像四极杆质谱仪那样扫描,因此使用单离子监测(SIM)或单离子记录(SIR)技术不能像四极杆和扇形质谱仪那样提高离子阱的灵敏度。快速傅里叶变换离子回旋加速器(FTICR)具有极高的质量测量能力,能够分辨紧密靠近的质量。虽然对大多数应用还不可行,但是14.5特斯拉的磁场能够取得超过350万的分辨率,因此能够区分质量相差小于单个电子质量的化合物。回旋加速器采用恒定磁场,通过静电平衡作用捕获离子。RF电压脉冲引起轨道离子运动,然后,在轨道上运动的离子在捕获单元的检测板上产生一微弱信号(离子轨道频率)。该频率与离子的m/z成反比,信号强度与单元中该m/z离子的数量成比例。在非常低的气压下,回旋加速器能够保持恒定的离子轨道,这样在长时间里,都能够进行超高分辨率的测量。持续非共振,辐射(SORI)是在傅立叶变换离子回旋共振质谱技术中使用的CID技术。在回旋加速运动中压力增加,离子被加速,引起碰撞,得到离子碎片。离子裂解后,压力减小,恢复高真空,以分析碎片离子。

TOF质谱仪已开发多年,因其快速、准确的电子组件和现代的电离技术(如ESI),已成为很多现代研究工作的基础。TOF质谱仪能提供准确的质量测量,误差范围是分子真实质量的几个ppm。TOF质谱仪为时间分散质量分析仪,使用时以线性方式,或需静电网格和透镜(作为反射板)的辅助。当以反射式操作时,分辨率增加,且无灵敏度的显著损失,或不需要增加飞行管(或漂移管)的大小。

TOF分析通过脉冲加速一组离子到达检测器。离开离子源后,每个离子从"推进"电得到一个相同的电荷或电势,离子被加速射进超低压管。因为所有带类似电荷的离子具有相同的动能(动能=mv2,m为离子质量,v是速度),在撞击到检测器前,较低质量的离子具有较高的速度和更小的间隔。因为质量、电荷和动能决定了离子到达检测器的时间,离子的速度可表示为v=d/t=(2KE/m)1/2。离子通过指定的距离(d)的时间(t)取决于质荷比(m/z)。因为每次 "电压推动"后,TOF测量的是所有质量数,所有相对于扫描型质谱仪,TOF质谱仪可得到非常高的灵敏度。如今,四极杆MS系统常规扫描速度为每秒10000Da(或原子质量单位)。因此一次全扫描,即使持续时间短的一次扫描(例如,1秒钟的LC或GC峰),在每秒内捕获每个离子的次数达不到10次或更多。TOF质谱仪检测器记录离子轰击检测板的数目,轰击彼此间隔时间为纳秒级。当直接与扫描质谱仪(比如四极杆)相比较,TOF的分辨率扩宽了动态范围,提供更高的分辨率。总的来说,当检测复杂混合物中的目标被测物时,四极杆类的仪器更灵敏感,通常是更好的定量工具。一些仪器,像离子阱,具有组合功能,但直到杂交型质谱仪出现前,没有单个质谱仪表现出全方位的高效性能。早期的MALDI-TOF的设计加快了离子离开离子源。该技术分辨率相对低,准确性有限。延迟提取技术(DE)是为MALDI-TOF质谱仪开发的一项技术,在离子形成后,加速离子在进入飞行管之前冷却"并聚焦离子大约150纳秒。与未冷却的离子相比,冷却的离子具有较低的动能分布,当冷却离子进入TOF分析器时,降低离子时间展宽,结果增加了分辨率和准确度。DE对大分子成效不显著(例如,蛋白质>30000Da)。

图 10:适合的指定条件下(比如,无基质干扰),当选择扫描模式工作时,TOF比串联四极杆的灵敏度高很多倍,因为TOF不用‘扫描',不会牺牲"占空比"。

杂交

"杂交"适用于各种质谱仪设计,杂交技术是现存技术的集成,比如双聚焦、扇形磁场和近来的"前端"回旋加速的离子阱。十分值得注意的一种杂交方式是四极杆飞行时间(QTOF)质谱仪,将TOF质谱仪和四极杆质谱仪组合在一起。这种是几种性能特征的理想组合:准确的质量检测、裂解分析的功能以及高质量的定量分析。

 

 

图 11:具有TriWave的SYNAPT 高性能质谱仪。

串联质谱技术的进一步发展,产生了离子迁移率测量和分离相结合的串联质谱技术技术。离子迁移率质谱法(或IMMS法,通常缩写为‘IMS')是基于多种因素的组合来区分离子的技术,这些因素包括:离子大小、形状、电荷和质量。IMMS通常在机场和手持领域的元件中使用,可对迁移率已知的小分子实现快速(20毫秒)检测:例如某些毒品和炸药的检测。当采用更高位的质谱仪,IMMS提供正交分离(对LC和MS),以及一些独特功能,包括:

- 分离异构体、同重化合物和构象异构体(从蛋白质到小分子),测定其平均转动碰撞横截面。
- 增强复杂化合物的分离(通过MS或LC/MS),引起峰容量增加和样品清洁度的增加(离子的物理分离,尤其是化学噪音和干扰目标分析物的离子)。
- 在结构分析研究中,通过CID/IMMS、IMMS/CID或CID/IMMS/CID等性能获得更多有用信息。

在所有的3个分析方案中,高效离子迁移率和串联质谱法的组合有助于克服分析中存在的问题,其它分析方法,包括传统的质谱分析法或液相色谱测试设备,可能也无法解决这些现存的问题。

在本章结尾引用了H.H.Hill Jr.等人的评论文章,比较了各种类型的离子迁移率(到文章2007年出版时,可用到的质谱仪),并描述了对各种被测物应用离子迁移率的益处。目前在质谱分析中,应用的4种离子迁移率分离方法:
- 漂移时间离子迁移率质谱法(DTIMS)
- 吸入离子迁移率质谱法(AIMS)
- 差异迁移率质谱法(DMS),也称为不对称场波形离子迁移率质谱(FAIMS)
- 行波离子迁移率质谱(TWIMS)

按照作者的观点,"DTIMS能提供更高的IMS分辨力,它是仅有的(IMMS)能够直接测量截面碰撞的方法。AIMS是低分辨的迁移率分离方法,但是它只能连续监测离子。DMS和FAIMS具有连续的离子监测能力,以及正交离子迁移率分离的功能,能够实现高分离选择性。TWIMS是一种新(IMMS)方法,其分辨能力相对低,但具有较好的灵敏度,能很好地与商品化的质谱仪工作结合。"

图 12:用彩球表示的,不同迁移率的无差异离子被俘获、累积,然后释放到T-波离子迁移率分离(IMS)装置中。

 

图 13:一旦释放进入T-波区域,行波波形驱动离子通过中性缓冲气(通常是0.5毫巴的氮气),按照离子迁移率分离离子。

 

离子迁移与MS联用,也应用在生物分子气相结构的研究。Pringle等(在此引用)应用杂交型四极杆-行波离子迁移分离器-正交加速TOF质谱仪,考察了一些肽和蛋白离子的迁移率分离。将从行波(TWIMS)分离设备上获取的离子迁移率数据与使用其它类型迁移率分离器获取的数据比较表明:"当迁移率特点类似时,新的杂交技术的质谱仪提供的迁移率分离不影响质谱仪的基本灵敏度。该功能在显著分析水平上有利于样品迁移率的研究。"

 

 
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