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技术

分离模式

反相液相色谱法

反相液相色谱是目前为止实验室中使用非常普遍的液相色谱分离技术,沃特世公司出产多种广受用户喜爱的色谱柱产品。

特别通用的色谱模式是反相色谱,它由极性流动相和非极性的固定相组成,典型的极性流动相是水或含极性溶剂的缓冲液,如甲醇,乙腈或四氢呋喃,非极性固定相是键合在硅胶或杂化颗粒上的烷基键。最近几年,科学家门在色谱分离介质的研究开发和应用方面投入很多,以改变色谱柱分离效果,增加其pH稳定性并提供互补的分离选择性。

来自沃特世公司的现代液相色谱柱大致分成三类:

  • 杂化颗粒技术色谱柱: 为更灵活的方法开发而设计,具有理想pH 稳定性的色谱柱。有XBridge™, ACQUITY UPLC® BEH 和 XTerra® 产品系列,pH 范围1-12。
  • 超纯硅胶相色谱柱: 十分常用的反相色谱柱。SunFire™ 和 Symmetry® 系列产品在沃特世公司Taunton工厂由超纯试剂及原料合成,为更大上样量而设计。pH使用范围 2-8。
  • 特别应用色谱柱: 特别为某一领域的应用而设计的色谱柱,如 Atlantis® 系列产品增强极性分子的保留。

正相色谱法

在反相键合相推出之前,正相色谱是十分流行的分离技术。它依赖于待分析物和固定相表面极性官能团的相互作用,当使用非极性溶剂作流动相时,这种相互作用最大。

正相色谱是一种非常强大的分离方法,因为有大范围的溶剂选择来调节分离选择性。然而,由于正相色谱比较复杂,其应用范围也受到了限制。在某些情况下,平衡时间较长,重现性也不好,如流动相中低浓度的极性污染物会影响分析的灵敏度。如果这些问题得到控制,相比反相方法,正相色谱由于经常使用低粘度溶剂,可得到更好的谱图。

正相色谱柱有SunFire™, Nova-Pak 和 Spherisorb 产品。

HILIC(亲水相互作用色谱法)

亲水相互作用色谱长期被人们使用,但是HILIC这个名词仅仅是最近才被使用。分析物通常是极性化合物,如极性代谢物,碳水化合物或肽。

HILIC 可以被看作正相色谱向水性流动相领域的延续。流动相是水相缓冲液(< 40%)及有机溶剂。固定相是强亲水性的极性吸附剂,如硅胶键合相,极性聚合物填料或离子交换吸附剂。这些固定相的共同特点是它们和水的作用力很强,因此属于“亲水性”。

HILIC模式使用的梯度和反相模式相反。初始条件包括高比例有机相,典型的浓度是95%有机相如乙腈,逐步降低到水相。因此,HILIC色谱又被称为反反相色谱(reversed-reversed-phase)。

沃特世公司HILIC色谱柱目前有Atlantis®和 ACQUITY® 系列产品。

离子交换色谱法

离子交换色谱分离中,蛋白质表面分布的净电荷决定了蛋白与填料表面带电官能团的相互作用。蛋白质表面的电荷必须与填料的电荷性质相反才能发生相互作用。可以控制的变量有缓冲液pH值,缓冲液浓度,梯度斜率和盐浓度梯度,为优化分离提供了一系列选择。

分子排阻色谱法

生物分子在溶液中的实际大小和形状不同是分子排阻色谱法的基础,其分离机理是根据生物分子的尺寸不同在填料中的保留时间不同得以分离。分子排阻色谱常用的填料有大颗粒的葡聚糖凝胶、聚合物填料以及高效耐压的小颗粒刚性填料等。

分子排阻色谱法在蛋白分离领域有广泛的应用,操作简单。同时,也可用分子排阻色谱来做缓冲液交换,因为低质量的盐分子很容易同蛋白质分开。

亲和色谱法

亲和色谱的原理是基于生物分子(例如,单克隆抗体或重组蛋白)与固定相配体的生物特异性相互作用而实现的。生物分子能得到生物活性的高回收率和较好的纯度。现代亲和色谱填料将坚固的耐碱填料,与增强的柱床稳定性相结合,达到将粗提样品从毫克至克级的高通量制备纯化分离。

疏水相互作用色谱法

疏水相互作用色谱法是常用的蛋白分离模式,其分离机理是蛋白在高离子强度缓冲溶液条件下,蛋白质溶解度降低,与中等疏水性的填料表面发生作用,然后将蛋白质用降低离子强度的梯度进行洗脱。该法分离度高,并能保持蛋白质生物活性。疏水相互作用色谱使用水相缓冲液系统,缓冲液的盐浓度和种类,缓冲液pH值,表面活性剂,改性剂,色谱柱温度和填料都会影响分离度。由于蛋白质在高离子强度下彼此也会发生相互作用,当待分离原料已有部分纯化时,可获得更高的分离度。而且高离子强度下也不方便大体积样品上样,如在疏水色谱分离前用硫酸铵沉淀,则是很好的选择。因此,疏水作用色谱是蛋白质纯化方案中很好的后续步骤。

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