高效液相色谱分离模式

总的来说,化合物的三种主要的性质可以用来产生高效液相色谱分离。它们是:
· 极性
· 电荷
· 分子大小
首先,让我们考虑极性和根据这一特性的两种主要分离模式:正相和反相色谱。

基于极性的分离

一个分子的结构、活性和物化性质由组成它的原子和化学键决定。在一个分子内部,决定了其特殊性质和可预测的化学反应的某些原子的特定排列,称为官能团。这个结构经常决定这个分子是极性还是非极性。有机分子根据它含有的主要官能团来分类。使用基于极性的分离模式,不同分子的相对色谱保留时间大都由这些官能团的本性和位置决定。如图 P 所示,不同类的分子可按照它们相对保留时间排列,形成从强色谱极性到强非极性的谱图。

图 P:分析物官能团的色谱极性图

水[带有强偶极矩的小分子]是极性化合物。苯[一个芳香族碳水化合物]是非极性化合物。具有相似色谱极性的分子相互吸引,如果极性不同相互的吸引力会减弱,极端的情况是相互排斥。这是基于极性的色谱分离模式的基本原理。另外一种方式来思考是以此类推:油[非极性]和水[极性]不相容。不像磁体是异性相吸,基于极性的色谱分离是根据相似物的相互吸引和不同物质的相互排斥。记住在基于极性的色谱中相似物相互吸引。

图 Q: 适当流动相和固定相的组合影响基于极性的分离

设计一套色谱分离系统[如图Q],我们通过选择流动相和固定相制造样品中各种化合物的竞争。这样,样品中和固定相[柱填料]极性相似的化合物将被延迟因为它们更强地被颗粒吸引。而和流动相极性相似的化合物将优先被吸引而移动较快。[ 基于极性的分离 ]极性分子非极性分子这样,基于流动相和固定相对不同化合物的相对吸引力不同,改变分析物速度就产生了分离。图 R-1, R-2 和 R-3 分别列出了流动相,固定相和样品分析物的典型色谱极性范围。我们看看每一种情况,色谱学家如何选择适当的流动相和固定相以形成吸附竞争,获得基于极性的高效液相色谱分离。

图 R-1: 流动相色谱极性谱图

一个坐标上,如图R-1,一些常用的溶剂按相对色谱极性形成的排列,称为洗脱顺序。与分析物有效竞争固定相的流动相分子,替换分析物,使得分析物在色谱柱中加速移动[弱保留]。水在流动相坐标的极性端,而己烷,一种脂肪族烃类化合物在非极性端。在两者之间,单一溶剂以及易混合的溶剂混合物[按比例混合以满足特殊要求],可以按洗脱强度顺序排列。最强流动相端的位置与分析物发生竞争的固定相表面性质有关。

图 R-2: 固定相颗粒色谱极性图

硅胶具有活性,亲水性表面,含酸性硅烷醇[含硅胶的乙醇同原物]官能团。因此,它在固定相的极性端,如图 R-2 所示。硅胶表面的活性或极性可与弱极性官能团相结合的化学键选择性地修饰。这里所举的例子是为了降低极性,氰基[CN],正辛基[C8],十八烷基[C18,ODS]与部分硅胶结合。后者是疏水性[憎水的]的,极强非极性填充方式。

图 R-3: 化合物/分析物色谱极性图

图 R-3 重复了我们样品的色谱极性图[如图 P]。考虑到流动相和固定相的极性,对于某一固定相,色谱学家必须选择一个流动相,使得感兴趣的分析物可以结合在色谱柱上,但不能太强而洗脱不下来。在具有类似极性强度的溶剂中,色谱学家考虑固定相和流动相的配合,可以区分分析物极性和溶解性的更微弱的差别,使色谱系统的选择性尽可能增大。同性相吸,但从目前的讨论可以想象,基于极性的分离是涉及到对样品的理解和各种分析物及保留模式的经验。总而言之,色谱学家会选择理想的具有合适相反相极性的流动相合固定相的组合。之后,当样品流过色谱柱的时候,同性相吸的原则将决定哪一种分析物流速放缓,哪一种流速更快。

正相高效液相色谱

在植物提取物的分离过程中,茨维特成功运用极性固定相[玻璃柱中的粉笔末; 如图A]和弱极性[非极性]流动相。这种经典的色谱模式被称为正相。

图 S -1: 正相色谱法

图 S -1 代表三个染料混合物的正相色谱分离。极性的固定相最强地保留了极性的黄色染料。相对非极性的蓝色染料在非极性溶剂的流动相保留竞争中胜出,很快被洗脱出来。由于蓝色染料最像流动相[两者都是非极性],它流动得更快。对硅胶柱正相色谱来说,典型的情况流动相是100% 有机相,不含水。

反相高效液相色谱

反相是指与正相恰好相反的色谱模式,即使用极性流动相和非极性[疏水性]固定相。图 S-2 描述了三种染料的黑色混合物被该种方法分离的过程。

图 S-2: 反相色谱法

现在最强保留的化合物是非极性较强的蓝色染料,因为它与非极性的固定相吸附最强。极性的黄色染料,较弱保留,在极性水性流动相的竞争中胜出,流过填料床最快,最早被洗脱出来--正是同性相吸。今天,由于其更好的重现性和更广泛的应用,反相色谱占所有高效液相色谱方法的75%。大多数方法使用水和极性溶剂的混合物,如乙腈或甲醇。这样一般来说能保证分析物与非极性,疏水性颗粒表面的适当相互作用。C18合硅胶[有时称为ODS]是非常普遍的反相高效液相色谱柱填料。图 S-2: 反相色谱法[ 反相高效液相色谱 ]表C给出基于极性分离的两种主要高效液相色谱的固定相和流动相特性的总结。记住,基于极性的模式,同性相吸。

表 C: 基于液相分离的两相特性

亲水作用色谱[HILIC]

亲水作用色谱[HILIC]可以看作是正相色谱的一种变化。正相色谱中,流动相是百分之百有机相。只有痕量水分存在于流动相和极性填料的空隙里。极性分析物与极性固定相较强吸附,不会被洗脱下来。在有机流动相[典型的是具有质子惰性的溶剂,如乙腈]中加入一些水分[<20%],就可能分离和洗脱在正相模式下强保留[或反相模式下弱保留]的极性化合物。水是强极性溶剂,和极性分析物有效竞争固定相。亲水作用色谱HILIC 可以在等度或梯度洗脱模式下运行。随着流动相极性[强度]的增加[加入更多水],最初吸附在极性填料颗粒的极性化合物可以被洗脱下来。分析物按照亲水性[相对水的色谱极性]由低至高的顺序被洗脱出来。缓冲液或盐可加至流动相中以保持离子化的分析物呈单一形式。

疏水作用色谱[HIC]

疏水作用色谱[HIC]是一种反相色谱用来分离大的生物分子,如蛋白。这些分子通常为保持原形而置于水溶液中,避免和会使其变性的有机溶剂或表面接触。HIC 通过疏水性固定相来达到大分子疏水目的,例如,是C4硅胶柱而不是C18硅胶柱。起始阶段,水中高盐浓度将帮助填料保留[盐析]蛋白。梯度分离经常是通过递减盐浓度来进行。这样,生物分子按照疏水性由低到高被洗脱出来。

基于电荷的分离: 离子交换色谱[IEC]

基于极性的分离,同性相吸,异性相斥。基于电荷的离子交换色谱和其他分离方式,规则是相反的,同性相斥,异性相吸。离子交换分离的固定相以表面酸碱性强弱和吸附保留的离子类型来划分。阳离子交换是用负电荷表面来保留和分离带正电荷的离子。反之亦然,阴离子交换是用正电荷表面来保留和分离带负电荷的离子[如图 T ]。每一种离子交换类型,都至少有两种分离和洗脱方法。

图 T: 离子交换色谱法

强离子交换体系具有易离子化的官能团[即,季胺类或磺酸类]。它们主要用于保留和分离弱离子。这些弱离子可被含有可更强吸附在固定相表面的离子的流动相洗脱或代替。或者,弱离子可以被保留在柱上,之后通过原位改变流动相的pH值被中和,使其失去吸附力而被洗脱。弱离子交换体系[如,二胺类或羧酸类]可能在某个pH值以上或以下被中和而失去保留带电离子的能力。当携带电荷时,它们用来保留和分离强离子。如果这些离子不能被替代物洗脱,固定相交换点可能被中和而切断离子化吸附,使得带电分析物被洗脱下来。

表 D: 离子交换纲要

当弱离子交换体系被中和,它们可以通过疏水性[反相]或亲水性[正相]相互作用保留和分离化合物; 在这样的情况下,洗脱强度由流动相的极性来决定[图 R -1]。因此,弱离子交换体系可用于混合分离模式[同时基于极性和电荷的分离].表 D 列出离子交换的主要分类纲要。例如,保留强碱性分析物[总是带正电荷],在pH值大于 7 时使用弱阳离子-交换固定相颗粒,可以产生阴离子颗粒表面。为了释放或洗脱强碱物质,降低流动相 pH 值至 3 以下; 可以去除表面电荷,切断离子交换保留机理。pKa 值是 50% 的官能团被离子化,50% 的官能团为中性时的 pH 值。为保证完全中性,或完全带电,分析物或颗粒表面pH值必须调整到比 pKa 值高两个数量级才合适[如表 D 所示]。不要使用强-阳离子交换体系保留强碱物质; 两者都带电荷并强烈地相互吸引,使得碱性物质几乎无法洗脱出来。只能用更强保留的竞争型碱物质来冲洗这个强阳离子交换体系,赢回活性交换位点,替换目标化合物。这种做法在高效液相色谱和固相萃取 SPE 几乎没有实用性,也不安全。[强酸和强碱在操作中很危险,可能对高效液相色谱流路材料具有腐蚀性] 。

基于尺寸大小的分离

排阻色谱[SEC] - 凝胶渗透色谱[GPC]十九世纪五十年代,Porath 和 Flodin发现生物分子可以通过过滤或流经孔径可控的亲水右旋糖苷聚合物时按照大小被分开,而不是基于电荷数或极性。这个过程被称为凝胶过滤。后来,一种类似的装置,使用特定孔径范围的有机聚合物填料可分离合成寡聚物和多聚物。这个过程成为凝胶渗透色谱[GPC]。使用孔径可控的硅胶填料操作类似的分离过程被称作排阻色谱[SEC]。世界上第一台用于 GPC 的商业化高效液相色谱仪出现在 1963 年[参见参考文献3].[ 基于尺寸大小的分离: 排阻色谱 ]

总结

所有这些技术通常是通过固定相来实现。这些固定相为使得感兴趣的分析物进入或不能进入孔内而被合成为一定孔径分布的填料。小分子在通过填料床时更多地进入到颗粒孔隙中。大分子只能进入某一尺寸以上的孔隙,所以在填料床停留的时间较短。最大的分子可能完全不能进入孔内而只在颗粒间通过,因此被小体积流动相很快洗脱出来。选择流动相有两个理由:第一,对被分析物来说是良好的溶剂;第二,可以防止被分析物和固定相表面的相互作用[基于极性或电荷]。这样,大分子先洗脱出来,小分子流动慢[因为它们流进更多的孔内再流出]而后洗脱出来,按照在溶液中的尺寸由高至低的顺序。因此,简单的规则:大的先出来。

由于可以将聚合物的分子量和溶液中的大小相关联,即 GPC 革命性地实现聚合物分子量分布的测量,那样就可以决定聚合物物理特征,从而可提升或减少聚合物生产工艺,质量和性能[如何分辨好的和差的聚合物].

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