谱带、色谱峰和谱带展宽

谱带是怎样形成的

将样品混合物从样品瓶中注入到流动的液体中[流动相]。然后,通过高压泵,流动相将样品输送到色谱柱头部处。接着,流动相携带样品进入色谱柱,经过颗粒床,从色谱柱中流出,再将被分离的混合物输送到检测器[图3]。

图3:HPLC系统图。

首先,让我们考虑一下,样品谱带是怎么被分离成独立的被测物谱带[绿色箭头表示流动方向]。图4A表示时间为零时,色谱柱的状况[此刻进样],此时样品进入色谱柱,开始形成一个被分离的谱带。此处提到的样品是黄色、红色和蓝色染料的混合物,在色谱柱的入口处为单个黑色样品谱带。

图4:理解色谱柱怎样工作-形成被测物带。

几分钟后,流动相连续稳定的流过色谱柱填料颗粒,我们能发现,不同的染料以不同的速度、按不同的被分离的谱带移动[图4B]。这是因为,流动相与固定相对每一种染料或被测物的吸引存在竞争作用。可以发现,黄色染料移动的最快,即将流出色谱柱。黄色染料对流动相的亲和力大于[被吸引]其它染料。因此,黄色染料以更快的速率移动,更接近于流动相的速度。蓝色染料谱带对填料的亲和力大于对流动相亲和力。这种对固定相颗粒较强的吸引力,使得蓝色染料移动速度显著降低。换句话说,蓝色染料是样品混合物中保留最多的化合物。红色染料带对流动相的吸引力介于中间,因此以中间速度通过色谱柱。因为每种染料谱带以不同速度移动,所以我们能够通过色谱法将混合物分离。

色谱带怎样形成峰

每一特定被测物谱带是由被测物分子组成的。带中心处的被测物分子浓度最高;而带的前部和尾部边缘浓度逐渐降低,作为样品带与流动相的交界 [图5]。

图5:被测物谱谱带中绿色被测物分子的浓度分布图。

当被分离的染料谱带离开色谱柱,立即进入检测器。检测器以流动相[参见图6]为背景,检测每一分离化合物谱带。选取适当的检测器[UV、ELS、荧光检测器、质谱等]能够检测出某种化合物的存在,并将响应的电信号传送给计算机数据工作站,在计算机上记录为一个峰。检测器对被测物谱带中特定分子浓度的改变产生相应信号,并且检测器检测被测物谱带的中心[被测物分子浓度最高],将其作为峰的顶点。

图6:当被测物通过检测器时,对被测物谱带的电子相应,数字化处理形成峰。

什么是色谱图?

色谱图是对HPLC系统中发生化学性分离[色谱分离]的表征。在时间轴上,从基线绘制出一系列峰。每一峰表示检测器对一不同化合物的响应。通过计算机数据工作站,绘制色谱图[图6]。黄色带已经完全通过检测器的流通池;产生的电信号已经发送到计算机的数据工作站上。检测生成的色谱图开始出现在屏幕上。注意,当样品进样后就开始色谱图记录,起始时是靠近屏幕底的一条直线。这条直线被称为基线;它表示纯流动相随时间流经流通池。当黄色被测物谱带通过流通池时,信号[信号的改变取决于被测物分子浓度]将发送到计算机。色谱线起初向上弯曲,然后向下,并与样品带中黄色染料的浓度成比例。这样在色谱图上形成了峰。当黄色谱带完全流出检测器的吸收池,信号水平将返回到基线;此时吸收池中仅有纯的流动相。因为黄色谱带移动最快,最先从柱子中洗脱,绘制出第一个色谱峰。过一会儿以后,红色谱带到达流通池。当红色谱带开始进入吸收池时,信号从基线上升,代表红色谱带的峰开始绘制。在这张图中,红色谱带没有完全通过流通池。如果我们在此刻停止色谱仪,该简图表明红色谱带或峰的状况。因为大多数红色带已经通过吸收池,所以大部分峰已经绘制出,如图6实线所示。如果我们继续色谱进程,红色谱带将完全通过流通池,红色峰将完整绘制[虚线]。蓝色谱带在色谱柱中强烈保留,以最慢的速度移动,在红色谱带之后洗脱。虚线表示,如果我们继续色谱分析进程,将得到的完整色谱图。有意思的是,蓝色峰宽度最宽,这是因为上柱时最窄的蓝色被测物谱带在离开色谱柱时变得最宽。变宽的原因是由于蓝色带缓慢通过色谱填料床,这样需要更多的时间[流动相体积]完全洗脱。因为流动相是以固定速度连续流动,这就意味着蓝色谱带变宽,浓度更稀。检测器的响应与谱带浓度成比例,因此,蓝色峰高度更低,宽度更宽。 

谱带展宽

在样品或被测物谱带到达检测器之前,将通过色谱系统的多个组成单元,这都将使色谱谱带失真并加宽[图7]。这种现象称为谱带展宽。当被测物谱带变宽,最终的色谱峰宽相应变宽。较宽的样品谱带产生稀释效应,将降低峰高,同时伴随着灵敏度和分离度的降低。与之相反,如果尽可能减小谱带展宽,将得到较窄的色谱谱带,从而获得更高的效率。因为较高浓度的被测物谱带具有较高的灵敏度和分离度,因此,更高、更窄的色谱峰便于检测器检测。因此,认识影响带扩展效应的因素、减少和控制那些影响因素并提高色谱的整体效能是很重要的。

图7:从进样器(样品带)进入、通过、然后出色谱柱(被测物带),接着进入检测器的流路中,出现带的扩展。

在色谱系统内,柱效应和柱外效应[色谱柱外的所有影响因素]都影响谱带展宽。柱外效应来源,包括进样体积、样品进样器与色谱柱之间的色谱仪流体路径、从色谱柱出口到检测器[包括流通池]和所有的连接件。谱带展宽的柱效应来源,包括填料的颗粒大小,色谱柱内填料填装方式,以及与流动相流速、被测物大小和几何形状相关的扩散特性。这些影响因素的方差(σ2)总和影响峰度[图8]。

图8:塔板数为一种统计函数,能作为总体方差[σ2],总体方差为柱外效应和柱效应方差之和。总体方差[σ2]估量体积的高斯峰[σ]狭窄程度,与洗脱体积相关。

为了显著改进液相色谱的性能,必须减少柱外效应和柱效应对谱带展宽的影响。ACQUITYUPLC系统基于降低两类种谱带展宽的理念,在分离效度和灵敏度上都取得了显著的提高[图9]。

图9:系统谱带展宽[色谱柱效应和柱外效应]对峰形的影响。

对柱外效应(色谱仪)谱带展宽的说明

为了实现色谱性能的显著提高,进行了大量工程方面的研究工作,设计了能承受小颗粒[小于2 μm]填料压力的液相色谱仪,同时使流路扩散尽可能减小,从而实现柱分离的理论性能。色谱仪是常规试验中可靠、耐用、精确的分析工具,这方面的性能相当重要。为了说明仪器设计的重要性,需要理解系统扩散[色谱仪+色谱柱带扩展]会如何影响色谱结果。

塔板数[N]或效率的测量需要考虑峰的扩散。峰的宽度直接与被测物带通过检测器时的宽度相关,而峰的顶点是分离物带中被测物分子浓度最大的一点。进行该类测定,需在等强度条件下实施。

图10列出了塔板数的计算等式,其中[Vn]是峰的稀释体积数,[w]是峰宽,[a]为常量,由峰高决定,并通过峰高测量出峰宽。只要峰完全对称,测量峰宽的每种方法将得到相同的塔板数。如果峰出现任何前伸或拖尾,这些测量方法得到的结果不同。

图10:确定塔板数的等式。峰宽越窄[w],塔板数越高。

有一个常见的误解,塔板数仅仅指的是色谱柱自身性能。但实际上,色谱柱和色谱仪引起的谱带展宽也会影响塔板数决定的峰宽。为了说明色谱仪自身对谱带展宽的影响,将一HPLC柱在两不同的色谱仪上运行;一种色谱仪为标准的HPLC[带扩展=7.2 μL],另一为ACQUITY UPLC系统[带扩展 = 2.8 μL]。因为相同的色谱柱在两类色谱系统上运行,色谱柱的谱带展宽认为是常量。ACQUITY UPLC系统上分离度增加,说明谱带展宽较小的色谱仪将得到较窄的色谱峰宽,塔板数更高[图11]。

图11:色谱仪谱带展宽对柱效应的显著影响。相同的色谱柱,在ACQUITY UPLC系统和常规HPLC系统上运行。[ACQUITY UPLC BEH C18 2.1 x 50 mm,1.7 μm色谱柱;流速=0.4 mL/min]。

管长和直径的影响

样品谱带由流动相进入色谱柱。设计的ACQUITY UPLC样品管理器用于大幅缩短进样器和柱入口的距离,目的是尽可能的减少谱带展宽。色谱柱将样品谱带分离成独立的被测样品谱带。然后色谱分离的被测物谱带,再从色谱柱输送到检测器。咋看来,一般认为连接色谱柱出口与检测器入口的管路内径[ID]不具重要作用。但是,实际上管路内径将大大的影响色谱仪的谱带展宽[图12]。

正如预计的一样,谱带展宽随着管ID的减少而减少。将浓缩的被测物带导入到大ID管中,带将变的更稀,导致峰加宽,峰变形,灵敏度降低。另外,沿管壁的摩擦会使得与管壁接触的被测物分子移动速度比管中心分子慢,结果导致带分布图变形。随着管ID减少,中心与被测物谱带外边缘之间的距离变小。这将减少谱带中变形分子的数量。尽可能减少管长度相当重要,因为管过长也会使样品谱带变形。

图12:由于管内径和长度引起被测物带扩展。

检测器设置对柱外谱带展宽的影响

除了色谱仪流体谱带展宽的影响因素外,相关采集速度和过滤常数的数字采集设置也会影响色谱分析的结果。这对UPLC应用尤为重要,因为峰宽通常非常窄[1-2秒宽],并且分析时间非常短。当设置检测器的采集速度时,选择项应当基于采集到色谱峰足够的数据采集点,以准确的反映出色谱峰形。检测器速率设置过高,将对信噪比造成负面影响,引起基线噪音增加,从而不能增加被测物的信号高度。相反地,如果检测器采集速率设置过低,整个色谱峰将得不到足够的数据点,降低了实测的色谱分析效率,和重复定量分析的能力。另外,时间常数[数字过滤器]用于平滑处理数据点,优化信噪比,能与采集速度联合或独立使用。

随着被测物谱带的宽度变窄,检测器的设置变的越来越重要。如果洗脱峰接近,这要求采集速度不但要足够快,以便数字化绘制出该速度的峰,而且UPLC色谱柱能实现高分离度分离。

以较慢的流速进行洗脱,导致色谱峰最后很分散,这时检测器的设置将不起作用。但是,当峰变的较窄,分析较快时[像UPLC中的分离],必须保持采集速度和时间常数的准确设置[图13]。当使用UPLC技术进行‘实时’应用时,需要准确选择检测器数据采集速率[Hz],这样才能准确扑捉最窄峰的峰形,然后应用过滤器时间常数[秒],得到分析的理想信噪比和分离度。

图13:采集速度[Hz]和时间常数[s]对峰形的影响。UPLC峰宽可能非常小[宽1-2秒]。因此,检测器的正确设置很重要。在ACQUITY UPLC BEH C18 2.1 x 50 mm,1.7 μm 色谱柱,流动相为65/35 ACN/H2O,ACQUITY UPLC系统,对二氢苊进行了等度分析。

 

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