合相色谱初学者指南

如何改进LC仪器以适配CO2

如前一章所述,从分离原理来看,CC与LC非常类似。即使从仪器角度来看,CC在各方面也类似于LC系统(见图9),只是它增加了一个组件 - ABPR,其作用是将整个系统加压至设定值以上。为了充分利用基于CO2的流动相的优势,同时赋予分离系统现代UPLC的优势,沃特世将关键系统组件替换为兼容可压缩溶剂的组件,对低扩散、耐高压的ACQUITY UPLC系统进行了改进。尤其值得一提的是,系统中包括用于计量CC系统流量的液化CO2泵。尽管首先会将CO2液化(例如,在13 ˚C下),但其可压缩性几乎比甲醇或乙腈高三倍。因此必须对泵进行改进,以实现可重现的合相色谱分析。

图9:ACQUITY UPC2系统组件和流路

以往分析型SFC系统面临的挑战

过去,业界普遍认为分析型SFC系统极不可靠。当时的SFC系统全都是在LC系统的基础上改造而成,而针对LC设计的泵、进样器和检测器并不适合CO2。

单级往复LC泵无法准确、可重现且可靠地压缩和输送CO2。它们并非为配合可压缩液体(如CO2)使用而设计,因此会导致流动相质量流速和质量组成波动。这会改变流动相的溶解能力,并且通常会使不同进样和不同系统之间出现保留时间漂移。

高度可压缩的基于CO2的流动相还会影响分析灵敏度,这是由泵和背压调节器产生的噪音导致的。此外,由于部分定量环进样的准确度和精密度较差,改造的HPLC仪器通常只能采用满定量环进样,限制了进样量选择。从系统层面上来看,改造后HPLC的系统扩散体积明显更大,会导致谱带展宽问题,因而无法使用更高效的1.7 μm颗粒色谱柱。对于改造自LC系统并采用基于CO2的流动相的系统来说,这些缺点极大限制了其分析通量以及可以达到的性能。

接下来,我们将介绍ACQUITY UPC2系统各个模块所采用的创新技术(图9)。

溶剂管理技术(泵)

为了准确、精密地控制流动相流速和组成,我们需要考察整个系统流路。如前文所述,改造后HPLC泵兼具压缩功能和准确输送指定体积溶剂的功能,无法处理CO2这样的可压缩流体。在某些SFC仪器中,流入的CO2会通过预压缩和冷却装置。该装置设置在色谱系统旁边(图10)。此装置距离泵越远,准确控制CO2质量流速的难度就越大,因为在预压缩与泵送步骤之间,CO2密度会因环境温度变化而发生改变。此外,传统SFC系统的泵送算法(内部控制软件)往往是为可压缩性相对较小的液体而设计,难以确保流动相组成的准确度、精密度和保留时间重现性。在尝试可靠地输送助溶剂比例较低的(小于5%)流动相时,也会发生同样的问题,因此采用这类系统难以分析不同极性的混合物。

 

图10:ACQUITY UPC2溶剂管理器与经改造用于超临界流体的HPLC泵对比

相比之下,Waters ACQUITY UPC2二元溶剂管理器(BSM)专为管理可压缩流体而设计,其配备了全面集成的预压缩装置,能够出色地控制质量流速和质量组成,因此能获得可靠且可重现的保留时间,而且基线噪音可忽略不计。如前文所述,在可压缩流体系统中,溶剂密度可控制流动相的溶解能力,因此实现精确控制对于确保重现性而言至关重要。专为可压缩和不可压缩液体组分设计的独立控制算法能够准确混合不同的流动相组分(包括低百分比助溶剂,图11),并且提供可重现的梯度曲线(图12)。

图11:精准混合压缩CO2与所需改性剂(甲醇比例以0.5%的增幅从1%增加到2.5%)

图12:以溶剂组成相差0.5%的设定梯度执行分析所得的谱图。此为10次进样的叠加谱图。上方色谱图运行开始时的改性剂比例为1%,下方色谱图运行开始时的改性剂比例为1.5%。由于流动相输送得到了精准控制,因此保留时间漂移被控制在极低水平。

图13:ACQUITY UPC2 BSM可精准混合CO2和所需的改性剂,即使组分比例低于5%亦是如此。单独的控制算法可补偿改性剂和CO2压缩以及压力改变和示差折光效应造成的偏差。

分析型SFC系统此前从未达到如此高的精准控制水平,尤其是在梯度分离控制方面。ACQUITY UPC2系统经过专门设计,能够精确控制泵吸取、压缩和输送操作,因此具有媲美UPLC的重现性。ACQUITY UPC2 BSM采用的体积密度控制优于质量流量控制,可提供出色的色谱精密度。这有助于控制洗脱时间和有效控制溶解强度。泵头本身可独立冷却,改善了CO2的密度控制,可实现准确的质量输送。泵和集成的压缩算法十分高效,控制也非常精确,因此无论是液态还是气态的CO2均可用作初始流动相。图13所示为BSM的内部构造。助溶剂泵是一个UPLC泵,而CO2泵则被黑色绝缘盖所覆盖。由于泵集成了压缩和冷却装置,因此绝缘盖有助于泵对流入的CO2实现更精确的密度控制。

进样

传统分析型SFC系统(无论使用满定量环进样器还是部分定量环进样器)往往难以可重现地注入小体积样品。大多数情况下只能执行满定量环进样,部分定量环进样很难保持进样溶剂的均一性。这会影响准确度、精密度和线性,不利于分析物的定量分析。每次进样都可能会浪费大量样品,因此分析人员通常需要手动更换样品定量环,大大限制了系统的灵活性。

图14:ACQUITY UPC2样品管理器与经改造用于超临界流体的HPLC进样器对比

图15:展示部分定量环进样重复性和重现性的色谱图示例

图16:从1至10μL,增幅为1μL的部分定量环进样的进样器线性

ACQUITY UPC2样品管理器采用了创新的双进样阀设计(图14)。这种设计可将主样品定量环排空至废液,从而使样品在大气压下进入定量环,与此同时维持流动相的均质性。此外,辅助进样阀设计可减小进样序列引起的压力波动并降低残留,从而实现可重复且具有结果再现性的部分定量环进样(图15)。该进样器可以0.1 μL的增幅执行0.1至50 μL的进样,并且具备双针冲洗选项,因此样品残留可忽略不计。图16所示为以1 μL增幅执行1至10 μL部分定量环进样的进样线性。

光学检测

有时,分析型SFC系统要进行光学检测比较困难。为HPLC系统设计的检测器流通池可能会产生不可接受的扩散体积和基线噪音。将示差折光检测器用于SFC时,会导致可压缩流体产生显著的基线噪音和基线弯曲,从而放大泵系统产生的噪音。RPLC常用溶剂(例如甲醇和水)的RI值非常接近(图17),因此反相方法中的RI效应通常不明显。CO2的RI值与甲醇(最常用的助溶剂)截然不同,因此物质的折射率范围比在LC分析中更宽,提高了基线噪音并限制了灵敏度。还有一个更棘手的问题是,基于CO2的流动相的密度在梯度分析过程中会发生变化,进而会导致其折射率发生变化。

图17:不同物质的折射率

图18:甲氧氯普胺的杂质分析谱图,展示了ACQUITY UPC2系统分析痕量杂质的适用性

ACQUITY UPC2 PDA检测器专为可压缩流体而设计,它并没有采用在低UV波长下会降低能量通量的蓝宝石棱镜,而采用了由高强度二氧化硅制成的棱镜,这种棱镜能耐受分离过程中产生的背压。这有助于大幅升灵敏度、降低基线噪音并补偿CO2与有机助溶剂之间的RI效应差异。为进一步提高基线稳定性并降低RI效应,该检测器还会对光学实验台进行热控制。低扩散性的不锈钢流通池有助于产生较窄的色谱峰,10 mm光程则能够大幅提升灵敏度,同时保持优异光谱性能。借助其出色的灵敏度,分析人员可对痕量杂质进行定量分析(图18)。 

质谱(MS)检测

为了适配其可压缩的流动相,CC对与之联用的光学检测仪器有着特殊要求,与此类似,与CC联用的MS仪器也必须进行适当改进,以便适应流动相的可压缩性。CC-MS接口必须能让流动相从加压状态降压至大气压水平(即目前的质谱仪离子源内部的压力水平)。如果不仔细考虑流动相压缩性,分析物到离子源的传输过程可能会受到负面影响。分析物传输效果欠佳可能导致峰形和/或电离效果不理想。最坏的情况是分析物根本不电离,导致质谱仪无法检出目标分析物。

压缩流动相的降压过程必须单独进行控制,与流动相流速控制、流动相组分控制以及通过自动背压调节器(ABPR)进行的柱后系统压力控制分开。此外,控制降压过程的措施不应该影响分析物到离子源的传输效率。为了实现上述目标,ACQUITY UPC2质谱接口针对可压缩流动相进行了专门设计,采用带补偿液功能的分流接口。该质谱接口借助分流限流器向质谱仪中引入流速恒定的流动相(压缩流动相的流速一般为300至500 μL/min)。剩余部分的流动相则被转移至ABPR,用以针对各种流动相流速和流动相组分实施柱后系统压力控制。ACQUITY UPC2质谱接口的示意图如图19所示,其中突出显示了分流接口和增加的补偿液。

图19:ACQUITY UPC2分流质谱接口示意图

CC-MS接口中的补偿液发挥着多方面作用。首先,电喷雾电离(ESI)操作要求流动相中含有约5%的改性剂。ESI是一种液相电离技术,因此电离时需要一定量的液体。正因如此,当流动相改性剂比例非常低时,流动相中的液体量达不到ESI的要求。所以,在改性剂比例较低的情况下执行ESI电离时,需要以补偿液的形式添加液体。其次,补偿液可协助传输分析物。在分流限流器的某一处,CO2将从高压致密状态转变为气态,失去其溶解能力。因此,在CO2转变为气态之后,只能借助液态的改性剂溶解分析物并将其传输到离子源中。若不添加改性剂或改性剂比例极低,则没有液体可通过分流限流器将分析物传输到离子源中进行电离。这种情况下就需要在分流限流器上游增加补偿液,用于将分析物传输到离子源。图20是一个示例,展示了分析物传输情况良好和欠佳时的色谱图。在该例中,我们通过选择补偿液流速得到了分析物传输情况欠佳(15A)和分析物传输情况良好(15B)的结果。

图20:示例峰形,展示了分析物传输情况欠佳(A)和分析物传输情况良好(B)的两种结果

当分析物在流动相液体改性剂中的溶解性较差时,补偿液在分析物传输过程中同样发挥着重要作用。有时,分析物在液体改性剂与压缩二氧化碳的混合物中溶解性极高,但在单独的液体改性剂中溶解性却较差。在这种情况下,即使存在高百分比的液体改性剂,当CO2在分流限流器中转化为气体状态之后,分析物仍有可能从溶液中析出。当分析物在液体改性剂中的溶解度不够时,会造成峰形不佳、接口管路堵塞和/或峰重现性欠佳等问题。添加合适的补偿液可增加分析物在新形成的液体改性剂/补偿液混合物中的溶解度,从而避免此类棘手问题。例如,高亲脂性分析物在CO2/甲醇流动相中的溶解性可能极高,但在纯甲醇中的溶解性可能相对较低。在这种情况下,可通过添加非极性补偿液降低液体改性剂/补偿液混合物的极性。亲脂性分析物在弱极性液体混合物中的溶解性将会更高,因此可以更轻松地将其传输到离子源中。

必要时,还可通过CC-MS接口中的补偿液将电离增强型化合物引入质谱仪中。这些化合物可以在色谱柱之后添加,以免影响分离。电离增强型化合物,如5%(按体积计)的水和/或20 mM氢氧化铵、甲酸或醋酸铵(选其中一种),通常可以改善ESI的电离效率。电离增强型化合物的浓度和种类具有极强的分析物专属性,分析人员应根据不同应用进行调整,以获得最佳响应。

为了获得最佳响应,在选定补偿液组分之后,还可相应地调节补偿液流速。可以根据MS响应筛选出一系列流速。流速过低可能导致分析物传输效果不佳,而补偿液流速过高往往会导致MS信号减弱。与补偿液组分类似,最佳补偿液流速同样具有分析物和方法专属性,要想获得最大信号响应,应根据不同应用对其进行优化。此外,换用不同电离技术时(例如从ESI切换至大气压化学电离(APCI)),应重新优化补偿液组分和流速。

综上所述,ACQUITY UPC2质谱接口专为可压缩流动相设计,可连接采用大气压电离技术(如ESI、APCI、ESCi®多模式电离、大气压光电电离(APPI)和UniSpray™)的现代质谱仪。

背压调节

对于任何需要处理可压缩溶剂的系统而言,精确控制并维持系统内部压力的能力都是非常重要的方面之一。正如我们所看到的,背压控制不精确会极大影响流动相密度,进而影响分析物的溶解和保留时间。传统SFC系统通常存在背压控制不精准的问题,其原因很多,包括:背压调节器(ABPR)的压力监测性能差、反馈定量环响应迟缓、步进电机分辨率低、泵对压力和流量的控制性能差以及ABPR部件磨损等等。

ACQUITY UPC2系统借助创新的双级动态和静态BPR技术提高了背压控制能力(图21)。通过将动态和静态背压控制技术相结合,可借助静态BPR使系统保持尽可能低的压力,而动态BPR则能够改善针对用户定义点的背压控制(图22)。为了进一步提高稳定性,还会对静态柱式BPR进行加热,以缓解流动相在ABPR出口处快速降压时可能发生的冰冻现象。双级BPR位于ACQUITY UPC2合相管理器(CM)内(图23)。该模块中还内嵌有用于流入CO2的在线颗粒过滤器、CO2渗漏检测器、排放阀、减压阀和辅助进样阀。

图21:ACQUITY UPC2系统合相管理器可确保背压始终如一,与设定值的偏差仅为+/- 5 psi,因此可提供出色的保留时间重现性和基线稳定性。

图22:双级动态和静态BPR可实现始终如一的性能,并且能精准控制保留性,以根据需要调整方法。

图23:ACQUITY UPC2合相管理器

整体系统性能

最后,ACQUITY UPC2系统具有扩散性低的固有特性,这一点与ACQUITY UPLC类似,因此可使用更小内径和更小粒径的色谱柱(图24)。窄内径的色谱柱可提高灵敏度、节省溶剂,还可采用更适合质谱仪的流速。更小粒径的色谱柱可提升分离效率并改善分离度。

图24:规格相同但粒径不同(5μm和1.7μm)的色谱柱在相同流速下的分析结果对比。色谱柱粒径从5μm降至1.7μm,柱效提高了三倍,灵敏度和分离度提高了将近两倍。

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