定量解析とキャリブレーション

臨床試験では多くのサンプルを扱い、また投与薬剤とその重要な代謝物があらかじめ明確に特定されています。このように化合物が既知の分析では、フルスキャンスペクトルは必ずしも必要とされません。さらに、複雑な生理混合物の場合には、高い感度が求められるため、装置は特定のm/zの値をモニターできるようになっています(この入門ガイドではSIMとMRMのレスポンスの比較について前述しています)。

トリプルまたはタンデム四重極では、イオンがその内部を絶え間なく流れるため、質量分析計に流れ込むイオン電流を制限する必要はありません。一方、イオントラップでは導入できるイオン量が限定されているため、あまりに多くのイオンがトラップに入るのを防ぐ機能が必要です。イオン量を制御しなければ、望ましくない、あるいは予期しないピークがスペクトル上に検出され、特にGC/MSでEIスペクトルのライブラリ検索を試みる場合に問題となります。イオントラップの設計は大幅に変化し、トラップ内に二次イオンを注入することにより、マスフィルタ内ではなく、マスフィルタ外でのイオン化が可能になりました。設計の変更によって、トラップでのイオン分子反応の問題を解決しましたが、一方で制限も加わりました。MRMモードでも、総イオン電流が自動制御されるため、クロマトグラム上で得られたピークの測定ポイントの間隔が不規則になったのです。このような問題のため、イオントラップの使用は、複雑なマトリックス中の微量成分分析で、非常に高い正確性や精度が必要とされる場合に限られています。例えばデータが法的に擁護される必要がある、あるいは定量の正確性や精度が厳しい基準によって法的に規制されている場合などが該当します。

質量分析計を用いて定量を行う際、通常は内部標準が使用されます。内部標準を使用することにより抽出プロセス、LC注入、およびイオン化における変動全般を補正することができます。内部標準を用いて繰り返し測定を行った場合、RSDは通常一桁台の前半に抑えられるのに比べ、内部標準を使用しなかった場合には、その10倍高い数値となることがあります。最も適切な内部標準は、分析対象とする分子が同位体で標識されたものです。こうした分子の合成には費用がかかるものの、抽出操作回収、クロマトグラフィーの保持時間、質量分析計でのイオン化において、目的成分と同様のレスポンスが期待できます。

 

GC/MSを使用しCI法でイオン化を行った定量分析の例 - ダイナミックレンジ5桁

 

システムの適合性を評価し、適切にサンプリングし、適切なカーブと濃度ポイントを決定することは、長い間議論されているテーマです。次のURLも参照してください。//www.ionsource.com/tutorial/msquan/requantoc.htm.

 

キャリブレーション
質量分析計のキャリブレーションは、イオンの相対強度と同様に、既知化合物の値を基準にしてマス軸を調節することによって行われます。装置の微妙な電気的変化、表面の清浄度および実験室環境が、重要な測定の再現性に影響することがあるため、この操作は全ての質量分析計で行われます。精度が整数質量レベルの質量分析計で、あまり精密な質量精度を必要としない分析を行う場合には、キャリブレーションよりもむしろ頻繁に、イオンのレスポンスを確認する必要があります。いずれにしても、高い質量精度を必要とする分析においては、微妙な変化を定期的に確認することが必要です。

GC/MSでは、パーフルオロトリブチルアミンとしても知られているFC‐43がキャリブレーション試薬としてよく用いられます。この他、高分解能質量分析計のマス軸を調整するために様々なキャリブレーション試薬が使用されます。NaCsIやポリエチレングリコールは、LC/MSのキャリブレーション用によく用いられます。一定流速でLC/MSで用いる溶媒と共にNaCsIを流すか、あるいはインフュージョンで装置に導入すると、4000Daまで一連のモノアイソトピックピークが検出されます。

マトリックス支援レーザー脱離イオン化(MALDI)質量分析計については、キャリブレーションやチューニング、感度確認に用いることのできる標準ペプチド、標準タンパク質、マトリックス、溶媒をセットにしたキットが販売されています。例えばシグマアルドリッチ社からは、タンパク質とペプチド(700~66,000Da)の複雑な混合物の分析を行うためのセットアップ用キットが販売されています。

 

ロックマス
最も困難が求められるTOFや同様の質量精度の高い装置には、持続的な防衛策が欠かせません。小さな温度変化だけでも、表示される質量が数ppmずれることがあります。使用されるイオン化法に依存しますが、キャリブレーションは、イオン化部にある既知の化合物を導入するだけで容易に行うことができます。また、分析の間中、適切なキャリブレーションをかけるために、イオンを周期的にサンプリングすることが可能です。単にロックマスキャリブレーション試薬をカラムの後または質量分析計のインレットの前に「Teeで混合する」ことでLC移動相に追加すると、イオン抑制や増強、溶媒効果のような制御できない現象を引き起こす原因となります。

飛行時間型(TOF)の装置では(この入門ガイドでも前述しています)、数ppmの精度で測定を行うことが可能です。また、フーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴(FITCR)型の装置では、導入され得るイオンの数が正確にコントロールされていれば、精度はさらに大きく向上します。マス軸のキャリブレーションが行われた質量に対して、ロックマスを用いた再キャリブレーションを行い、質量の誤差を減少させることができます。見落とされることもありますが、シグナル強度が弱くても質量がずれます。これは、クロマトグラム上で得られたピークの質量について、シグナル強度に重みをつけて平均化することによって補正することが可能です。

精密質量データを取得するのに最適化されたデュアル・エレクトロスプレーイオン源は、プロテオミクス研究や低濃度の代謝物の同定をするのに理想的なシステムです。ステッピングモーターを制御して、バッフルを往復させることにより、2つの独立したESIプローブから放出されるサンプルスプレー(またはリファレンススプレー)を取り込むことが可能です。サンプルスプレーを早い周期で取り込みながら、一定の間隔でリファレンススプレーもサンプリングします。取り込みを制御しているバッフルの位置はリアルタイムで監視されており、2つのインレットからの取り込み状況を確認することができます。またリファレンスとサンプルのデータは別々のファイルに格納されます。これにより、分析対象とリファレンスチャンネルの間のクロストークを防ぐことができます。

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