COVID-19 から学ぶもの：LC-MS 適合の移動相と親水性相互作用クロマトグラフィーを用いたアジスロマイシンの分析

アジスロマイシンは広く使用されている抗生物質であり、ウイルス性呼吸器疾患の治療において成功例が見られています。  新型コロナウイルスのパンデミックの結果として、アジスロマイシンの単独使用または他の薬剤との併用が、さまざまな患者集団の新型コロナウイルス感染症の治療に有用であるかを検討する研究が開始されました。初期の臨床研究に動機付けられて、ウォーターズはアジスロマイシンの分析法の改良に関する研究を開始しました。アジスロマイシンについて、現在承認されている USP モノグラフでは、通常の L1 ケミストリーから特殊な固定相に至るまで、様々なカラムケミストリーでリン酸カリウムバッファーを含む移動相を使用しています。モノグラフは有用な出発点となりますが、MS 適合の移動相の導入により、汎用性を高められることがあります。親水性相互作用クロマトグラフィー（HILIC）の使用により、逆相条件を使用して得られる分離を補完することができます。

アプリケーションのメリット

•  引用されている逆相分離と比較して、左右対称の狭いピークが得られる
•  移動相の高有機溶媒濃度による MS シグナル強度の向上

広く使用されている抗生物質アジスロマイシン、およびクラリスロマイシンなどの他のマクロライド系抗生物質は、インフルエンザなど、他のウイルス性呼吸器疾患の治療において成功例が見られています^1,2。このため、SARS-CoV-2 の治療薬候補として、アジスロマイシンの単独使用または他の薬剤との併用が有用であるかを検討する研究が開始されました^3、4。アジスロマイシンの一部の治験は特定の新型コロナ患者集団で継続していますが、入院患者を対象にヒドロキシクロロキンとアジスロマイシンを併用する治験は、少なくとも 1 つが中止されました⁵。

新型コロナウイルスのパンデミックの初期段階でアジスロマイシンの臨床研究が積極的に進められている一方で、ウォーターズでは、分析性能の改善という潜在的なニーズに応える新しい分析法を検討しました。アジスロマイシンの最適な分離および特性解析を実現するために、様々な分析条件を用いて試験が行われました。一般的なスクリーニング条件と ACQUITY UPLC BEH Amide カラムを使用して、アジスロマイシンを HILIC モードで分析することに成功しました。一般的な逆相 LC 条件と比較して、左右対称の狭いピークと、強い MS シグナルが得られたことから⁶、バイオアナリシスアプリケーションでの低濃度での分析において有利になります。

アジスロマイシンを新型コロナウイルスの治療に使用するかどうかに関わらず、この新しい分析法はアジスロマイシンの一般的な分析に有用であり、バイオアナリシスアプリケーションにおける低濃度分析を必要とする同様の治療用分子にも適用できる可能性があります。

アジスロマイシンは Sigma-Aldrich から購入し、95:5 のアセトニトリル/水で 5 μg/mL に希釈しました。XEVO TQD 質量分析計を組み合わせた ACQUITY UPLC H-Class システムで、ACQUITY UPLC BEH Amide カラム（2.1 × 50 mm、1.7 μm）とギ酸アンモニウム（10 mM pH 3.0）移動相を使用しました。分離には以下のグラジエントメソッドを使用しました。95:5 のアセトニトリル/水でアイソクラティックホールドを 1 分間行った後、70% 水溶液まで 7 分間のリニアグラジエントを行いました。その後、次の注入用にカラムを初期条件で再平衡化しました。移動相の pH および塩濃度は、グラジエントを通じて一定に保ちました。流速 0.5 mL/分で 1 μL の注入を行いました。カラム温度は 30°C に設定しました。陽イオンのエレクトロスプレーイオン化とマルチプルリアクションモニタリングを使用して、m/z トランジションは 749->591 および 749->158 で、アジスロマイシンが検出されました⁴。

以下のクロマトグラムは、アジスロマイシンについて観察された結果を示しています。左右対称性が優れた狭いピークが得られました。記載した試験条件では、約 30% の水系移動相で溶出しており、さらに分析法の最適化が行われました。また、このような良好な保持力により、しばしば MS の感度の問題を起こす保持されないマトリックスの化合物とはピークが共溶出しませんでした。引用されている逆相分析法と比較して、この分析法ではよりシャープなピークが得られることから、生体サンプルで重要となる低い検出限界が容易に達成されます。更に、この HILIC 分析法で使用した高有機溶媒濃度の移動相により、逆相分離と比較して、MS の感度が向上しました。

アジスロマイシンが新型コロナウイルス感染症の治療に役立つであるかどうかにかかわらず、信頼性が高く、堅牢なアジスロマイシン分析法は、バイオアナリシスのアプリケーションにおいて重要です。アジスロマイシンは逆相 LC によって分析できますが、HILIC を使用することにより、複数のメリットが得られます。まず、逆相アプリケーションは主に水系または弱溶媒の移動相に制限されますが、HILIC でのこの極性分析種の保持が優れていることから、分析法の最適化が可能になりました。また、HILIC で使用する高有機溶媒濃度の移動相により、MS アプリケーションでの感度が向上しました。これにより、バイオアナリシスワークフローで通常見られる低濃度分析種について、より優れた検出が可能になりました。アジスロマイシンの調査が続けられる中で、このようなバイオアナリシスワークフローは、ますます重要になることが予想されます。HILIC により、分析者の労力を最小限に抑えつつこれらのメリットが得られると考えられます。

1. https://www.nih.gov/news-events/news-releases/nih-begins-clinical-trial-hydroxychloroquine-azithromycin-treat-covid-19
2. Tran DH, Sugamata R, Hirose T, Suzuki S, Noguchi Y, Sugawara A, et al.Azithromycin, a 15-membered macrolide antibiotic, inhibits influenza A(H1N1)pdm09 virus infection by interfering with virus internalization process.J Antibiot (Tokyo).2019;72(10):759-68.
3. Miyamoto D, Hasegawa S, Sriwilaijaroen N, Yingsakmongkon S, Hiramatsu H, Takahashi T, et al. Clarithromycin inhibits progeny virus production from human influenza virus-infected host cells.Biol Pharm Bull.2008;31(2):217-22.
4. Filist, M, Bus-Kwasnik K, Ksycinska H, Rudzki, P. Simplified LC-MS/MS method enabling the determination of azithromycin in human plasma after a low 100 mg dose administration.Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. (2014).184-189.