HILIC ベースの LC-MS クロマトグラフィーをメタボロミクス研究に使用する場合の、極性低分子に対するクロマトグラフィー性能の評価

本アプリケーションブリーフでは、HILIC および BEH Amide カラムケミストリーの、親水性極性代謝物の分離における性能と頑健性、およびそれらの代謝物プロファイリング研究に対する適合性を評価しています。

アプリケーションのメリット

BEH Amide カラムは、極性化合物保持能、クロマトグラフィーピーク形状、および標準混合物とヒト尿の分析における再現性において優れていることが実証され、大規模なメタボロミクス研究に適していることが証明されました。

代謝物プロファイリング研究で通常使用される生物学的マトリックスは、多くの生化学的プロセスできわめて重要なさまざまな低分子で構成されます。クエン酸サイクルやアミノ酸代謝に関連する経路には、逆相（RP）クロマトグラフィー条件での保持と分離が困難な極性の高い化合物が含まれます。親水性相互作用液体クロマトグラフィー（HILIC）は、極性の代謝物の分析に適した技法で、これらの化合物の親水性の性質をカラムへの保持に利用します。HILIC カラムは通常、極性官能基を含む一部の固定相と非修飾シリカ粒子で構成され、広範な極性、pKa、構造的部分にわたる極性分析化合物の保持および分離が改善しています。生体マトリックスに存在する分子の多様性、そして物理化学的特性における基本的な差異により、プロファイリング実験における修飾固定相の、非修飾固定相と比較した場合の真価がわかります。

極性の保持/分離における非修飾固定相と修飾固定相の違いを評価するために、Waters BEH HILIC 非修飾シリカカラム（製品番号：186003461）およびBEH Amide カラム（製品番号：186004801）の 2 つの HILIC カラムを、調査用に選びました。カラム特性の違いを評価するため、Waters LCMS QC レファレンス標準試料混合物（製品番号：186006963）および極性内因性化合物のカスタマイズした混合物を、4 種の異なる移動相条件（表 1）で分析しました。カスタマイズした極性化合物混合物には、フェニルアラニン、タウリン、ベタイン、クレアチニン、馬尿酸、安息香酸を含めました。100% 水溶液として供給された各標準溶液をアセトニトリルで 1:4 に希釈し、繰り返し注入しました（n = 6）。すべてのカラムおよび移動相条件において、カラム温度は 40 ℃ に維持し、グラジエントプロファイルは 7 分間で 0 ～ 100% A でした。移動相の流量も、すべての条件において 0.5 mL/分に維持しました。

すべてのデータは、分解能モードで動作する Waters SYNAPT XS システムを使用して取り込み、ポジティブイオン化モードでデータを収集しました。各標準試料の抽出イオンクロマトグラムを、MassLynx および Skyline（MacCoss Lab, University of Washington, Seattle, USA）を使用して解析しました。ここでは、評価したあらゆる条件にわたって最適なカラムを決定するために、ピーク幅（Wb）、保持係数（K）、選択性（α）、理論段数（N）などのクロマトグラフィー性能の特性を計算しました。

生成したピーク幅の範囲を調べることにより、アミドカラムの方が、4 種の移動相条件すべてにわたって平均幅 4 ～ 5 秒と、一貫性にはるかに優れていることがわかりました（図 1）。BEH HILIC カラムではピーク幅がより大きくばらつき、酢酸アンモニウムを加えることによって改善することがわかりましたが（図 2）、ピーク幅は最終的に 2 ～ 9 秒の範囲でした。

保持係数（K'）は、カラムの保持性能および保持容量の指標です。K' 値 1 ～ 10 は通常、分析法の開発およびバリデーションでは許容可能と考えられています¹。 図 3 に、両方のカラムを使用して 4 種の移動相条件すべてで分離した LCMS QC レファレンス化合物の平均 K’ 値を示しています。両方のカラムで、評価した移動相条件のほとんどで 1.5 を超える平均 K’ 値が得られていますが、BEH Amide カラムの方が、4 種の移動相条件すべてにおいてより一貫していることがわかります。 

これらの観察結果に基づき、両方のカラムについて、移動相 3（10 mM 酢酸アンモニウム）で最適なクロマトグラム性能が得られ、同様のピーク幅と K’ 値が得られました（それぞれ図 1 および図 3）。図 4 のクロマトグラムからわかるように、BEH Amide カラムの方が、LCMS QC レファレンス標準試料の分離に優れており、多くの極性標準試料に対する保持能がより良好でした。

概説した評価に基づいて、最適化したクロマトグラフィー条件を使用したヒト尿の 200 回の注入を取り込む（分析時間 34 時間）ことにより、BEH Amide カラムの再現性を評価しました。これらの結果により、分析期間全体にわたって再現性が優れていることが実証されました（図 5）。

この調査により、包括的代謝物プロファイリング試験における、修飾固定相カラムの、従来の非修飾 HILIC カラムと比較した場合の利点が明らかになりました。複雑なマトリックス中の極性化合物の分析において、化合物保持、ピーク形状、再現性が向上していることが実証されました。BEH Amide カラムは、LCMS QC レファレンス標準品において、選択性が向上し、ピーク分離度が高いことが実証されました。

さらに、バッファー移動相の追加によって、化合物と固定相の相互作用が強化され、ピークがシャープになってクロマトグラフィー分離が向上しました。ヒト尿内にスパイクしたレファレンス標準品の評価により、HILIC Amide カラムを使用する最適化した分析法において、200 回の注入にわたって再現性が優れていることがわかりました。

1. Reviewer Guidance – Validation of Chromatographic Methods, Center for Drug Evaluation and Research (CDER), November 1994.