分析級及製備級管柱

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技術

分離方式

逆相層析(Reversed-phase Chromatography)

逆相層析是到今日為止在實驗室中最常使用的液相層析分離技術,其普遍性反映在對於Waters目前提供之管柱產品的大量選用。

逆相層析最簡單的形式,包含了一個極性的移動相及一個非極性的固定相,極性的移動相一般是將水或是緩衝液與極性溶劑例如甲醇、乙腈或四氫呋喃混合而成,非極性的固定相為例如鍵結於矽膠或混合支持體之長鏈烴。近年來,在分離材料的領域,針對於改良管柱效率、pH安定性並提供替代選擇性,已有重大的研發努力成果。

Waters 的最新管柱化學成分可以大致分成以下三個類別:

  • 雜化顆粒(Hybrid):酸鹼耐受範圍廣,適用的分析方法更為彈性。管柱品牌有XBridge™、ACQUITY® BEH,與XTerra® brands。pH範圍1-12。
  • 矽膠管柱(Silica):傳統上最常被使用在逆相層析的材質。管柱品牌有SunFire™ 與Symmetry® products,這兩個品牌從原料到產品都出自Waters位於美國麻州的 Taunton工廠 。其上樣量大, pH範圍是 2-7。
  • 特殊應用的管柱(Application-specific):針對特殊應用領域,如 Atlantis® 管柱可以強化極性化合物的滯留效果。

正相層析(Normal-Phase Chromatography)

在發展逆相層析前,正相層析是最普遍使用的分離技術。正相層析分離的原理主要是利用做分析物與固定相表面極性官能基的交互作用,輔以非極性溶劑的使用來決定哪一方作用力強,而達到分離效果。

正相層析技術是很有用的分離方法,因其溶劑的選擇多,可做為分離時方法微調的好工具。然而,由於正相層析過於複雜,多數人並不喜歡使用它。在某些情況下,當移動相中有少量的極性物質時,因為正相層析感度的限制,在分析樣品上會有過長的平衡時間與再現性差的問題。如果能夠控制這些問題,正相層析技術會比逆相層析技術佳,這是因為正相層析使用的有機溶劑黏度較多之故。

在Waters正相層析管柱的品牌有SunFire、Nova-Pak與Spherisorb等系列產品。

親水性作用層析技術 (Hydrophilic-Interaction Chromatography, HILIC)

親水性作用層析技術已經發展一段時間,但是HILIC這個名稱直到最近才普遍使用。用來分析的樣品是非常極性的化合物,如極性代謝物,碳水化合物或胜肽。

HILIC在水相移動相的分類中視為正相層析技術的一種延伸。HILIC的移動相是由水或與緩衝溶液(小於40%)與有機溶劑混合而成。固定相是親水性吸附材質,如:矽膠,極性鍵結相、極性高分子填充物,離子交換等。這些固定相的共通點在於它們都很容易與水結合,因此被歸類為『親水性』這一類。

在HILIC所使用的梯度方法與逆相層析上的完全不同。一開始溶劑比例是由高有機相(約95%)慢慢置換成較高的水相。也因為HILIC的操作不需要像傳統正相層析那樣麻煩,所使用的移動相種類也與逆相層析相似,因此HILIC技術越來越普遍。

由於這項技術正逐漸普及化,因此這類管柱的相關研究也逐漸增加。

在Waters HILIC管柱的品牌目前有Atlantis、XBridge與ACQUITY®等系列產品。

離子交換層析(Ion-exchange Chromatography)

於離子交換分離,在蛋白質表面的電荷分布及淨電荷決定了蛋白質與填充材表面上的帶電基團間的交互作用。為了發生交互作用,蛋白質與填充材料的電荷必需為相反的。可操縱的變因,例如緩衝液pH、緩衝液組成、梯度的斜率,以及梯度形成鹽類,可用來作為使分離條件最適化的多樣選項。

分子篩選層析(Size-exclusion Chromatography)

分子大小篩選層析是依據溶液之中,生物分子的外觀大小及外形來進行分離。以此簡單的分離機制解析蛋白質混合物,係仰仗生物分子的大小差異、填充材料、孔徑、顆粒大小,以及操作條件,例如樣品的質量及體積。分子大小篩選填充材可來自於大分子多醣類軟性凝膠,到小型堅硬的填充材料,此等能提供加強的解析力以及顯著較快的分離效果。

分子篩選在蛋白質單離方面應用廣泛。由於此技術之操作時間短及相當地簡單易操作,因此常用在分析餾分。此法亦可將低分子量的鹽類分子輕易地從較大分子的蛋白質中分離,故也能應用在更換緩衝液。

親和性層析(Affinity Chromatography)

親和性層析是將生物分子(例如,單株抗體或重組蛋白質)基於與固定化配體間的生物專一性交互作用來單離的唯一的一種層析模式。生物分子可以高產率的生物活性以及良好純度回收。現今的親和性填充材利用了硬式鹼性材料的優點,其對於粗製樣品處理提供加強的充填密度安定性,並且能以高效率進行微克至克級的親和性純化。許多的分離可單一步驟達成,因而減省了許多分離的花費。

疏水性交互作用層析(Hydrophobic-interaction Chromatography)

蛋白質表面會形成中等疏水特性,進而與鍵結相產生疏水作用。蛋白質以遞減之離子強度被沖提。疏水性交互作用層析通常具有良好的解析力,且保留了生物活性。在疏水性交互作用中,使用水性緩衝系統。影響解析力的許多不同的因素,包括:緩衝鹽類濃度及形式、緩衝液pH、表面活性劑、修飾劑、管柱溫度、填充材機能。由於在高離子強度之下,蛋白質可能會互相作用,因此採用已經經過部分純化的起始樣品,將能得到較佳的解析力。於高離子強度之下,載入多量體積的樣品也不方便。因此可知疏水性交互作用通常較佳是在單離流程中,作為第二或接續的步驟,例如先進行硫酸銨沉澱再進行層析步驟。