HPLC - 高速液体クロマトグラフィー(液クロ)入門・原理

HPLC(高速液体クロマトグラフィー: 液クロ)とは

歴史の概略と定義
今日のクロマトグラフィーの主流である、高速液体クロマトグラフ(HPLC: 液クロ)のもとをなす、液体クロマトグラフィーは、1900年代初頭にロシアの植物学者Mikhail S. Tswettの研究により定義されました。彼の先駆的な研究は、植物から抽出した化合物(葉の色素)を粒子を詰めたカラムで溶媒を用いて分離することに着目していました。

Tswettは、両側が開いたガラス製カラムに粒子を詰めていました。粒子に有用な物質として彼が発見した2種類の材料は、粉末チョーク(炭酸カルシウム)とアルミナでした。彼はサンプル(均質化した植物の葉の溶媒抽出物)をカラムに注ぎ、粒子のベッドを通過させました。その後、溶媒のみを注ぎました。サンプルが重力によりカラムを下降するにつれて、異なる色の帯が現れます。これは、化合物の種類により下降速度が異なるからです。彼は、この分離した異なる色の帯を、サンプルに元来含まれていた異なる化合物と関連付けました。彼は、各化合物の粒子に対する親和力の違いに基づいて、これらの化合物の分離分析を可能にしました。粒子に対する親和力が大きい化合物は低速で下降し、溶媒に対する親和力が大きい化合物は高速で下降します。このプロセスは、次のように説明できます。サンプルに含まれる化合物は、移動する溶媒(移動相)と粒子(固定相)との間で異なって分布します。これにより、各化合物は異なる速度で移動して、化合物が分離します。

Tswettは、この色彩的な実験を表すためにクロマトグラフィー(色を示すギリシャ語の「クロマ」と書き込み「グラフ」、つまり「色による書き込み」)という名前を造語しました(興味深いことに、彼の名前Tswettはロシア語で「色」を意味します)。現在、高速液体クロマトグラフ(HPLC: 液クロ)を代表とする、液体クロマトグラフィーにはさまざまな形態があり、分析化学で最も強力なツールの1つとなっています。

図A : Tswettの実験

液体クロマトグラフィー(LC)の手法
液体クロマトグラフィーは、いわゆる高速液体クロマトグラフィー(HPLC: 液クロ)だけではありません。液体クロマトグラフィーは、平面的手法(手法1と2)、またはカラム手法(手法3)で実行できます。カラムによる液体クロマトグラフィーは最も強力で、サンプル容量が最大です。いずれの場合でも、サンプルをはじめに液体に溶解する必要があり、次にその液体をクロマトグラフィー装置に送液します。

手法1。サンプルがガラスプレート表面に固定されたクロマトグラフィー粒子の薄層(固定層)の表面に付着され、その後サンプルがその薄層内を流れます(図B)。プレートの下端が溶媒に浸けられています。溶媒(移動相)が乾燥した粒子層に拡散し、ガラスプレートを上昇するキャピラリ動作によりフローが発生します。この手法は、薄層クロマトグラフィー(TLC)と呼ばれます。

図B : 薄層クロマトグラフィー

黒のサンプルはFD&Cの黄、赤、青の食用色素の混合物で、クロマトグラフィーにより各色に分離されています。

手法2。図Cのサンプルは、紙(固定層)の表面に付着されます。次に溶媒(移動相)が付着部中心に加えられ、外側に放射状のフローが発生します。これは、紙クロマトグラフィーの1形態です(伝統的な紙クロマトグラフィーは、直線的なフローを持つTLCと同様の方法で実行されます)。上の図では、同じ黒のFD&C色素サンプルが紙に付着されます。

図C : 紙クロマトグラフィー

この紙の分離能力をTLCプレートと比較したときの差に注意してください。緑の輪は、この紙が黄と青の色素を相互に分離できないが、黄と青を赤の色素からは分離できたことを示します。下の図では、同じ黄と青の色素で構成された緑のサンプルが紙に付着されます。予測どおり、この紙は2つの色素を分離できません。中央の図では、赤と青の色素で構成された紫のサンプルが紙に付着されました。赤と青はうまく分離されています。

手法3。この最も強力な手法では、適切な粒子(固定層)が充塡されたカラムまたはカートリッジ機器の中をサンプルが通過します。これらの粒子はクロマトグラフィー充塡材と呼ばれます。溶媒(移動相)が機器内を流れます。固相抽出(SPE)では、サンプルはカートリッジに入れられ、溶媒フローがサンプルを搬送します。Tswettの実験と同様に、サンプル内の化合物は機器内をそれぞれ異なる速度で移動し、これにより分離されます。ここでは、黒のサンプルがカートリッジに入れられます。分離の各段階で異なる溶媒が使用されます。
 

図D-1:カラムクロマトグラフィー – 固相抽出(SPE)

カートリッジ方式を使用する場合、フローを発生するには複数の方法があります。非耐圧カラムには、重力または吸引を使用できます。通常、この場合の粒子の直径は大きいので(> 50 μm)、フローに対する抵抗は小さいです。両側が開いたガラス製カラム(Tswettの実験)はこの1例です。さらに小型のプラスチック製カラム(通常はシリンジの円筒形)に充塡材の粒子を詰めて、サンプル分離に使用できます。これは、固相抽出(SPE)と呼ばれます。ここでは、分析をさらに進める前に、クロマトグラフィー機器(カートリッジ)を使用して、通常は吸引支援フローにより非常に複雑なサンプルを洗浄します。

分離能を向上するには、さらに微細な粒子サイズ(<10 µm)が必要です。ただし、粒子を小さくするとフローに対する抵抗が大きくなるので、必要とする流速を得るには高圧が必要です。高圧に耐えるポンプとカラムが必須です。クロマトグラフィーのカラム内で溶媒が流れるために中~高圧を使用する手法をHPLCと呼びます。

高速液体クロマトグラフィー(HPLC: 液クロ)とは
Csaba Horváth教授が1970年にPittcon® の論文で命名した頭字語HPLCは、当初、充塡したカラムで液体クロマトグラフィーを実施するために必要なフローを発生するために、高圧が使用されたという事実を表していました。当初のポンプ能力は500 psi(35 bar)しかありませんでした。この手法は高圧液体クロマトグラフィー(HPLC)と呼ばれていました。1970年代初期に、テクノロジーが大幅に飛躍しました。この時期の新しいHPLC装置は、圧力が最大6,000 psi(400 bar)に上昇でき、改善されたインジェクタ、検出器、およびカラムが組み込まれていました。実際には、HPLCの確立は1970年代中~後期に始まりました。この時期の継続的な性能の向上により(粒子の微細化、高圧化)、頭字語は同じですが、名前が高性能液体クロマトグラフィー(HPLC)に変化しました。

高速液体クロマトグラフィー(HPLC)は現在、分析化学で最も強力なツールの1つとなっています。液体に溶解可能な任意のサンプルに存在する化合物の分離、同定、および定量ができます。現在、1兆分の1(ppt)ほど微量の濃度を持つ化合物も容易に同定できます。HPLCは現在、および過去も、製薬、食品、栄養補助製品、化粧品、環境マトリクス、法医学サンプル、産業化学物質など任意のサンプルに適用でき、今日ではHPLC以外にも、高速液体クロマトグラフ、液クロなどの名称で呼ばれています。

図D-2 : HPLCカラム

高速高分離液体クロマトグラフィー(UPLCテクノロジー)とは
2004年に、装置とカラムのテクノロジーが一層進歩し、液体クロマトグラフィー分離能、速度、および感度を著しく向上させました。新段階の性能を達成するには、微細粒子(1.7 µm)を持つカラムと、15,000 psi(1,000 bar)で移動相を送液する特殊機能を有する装置が必要でした。超高速高分離液体クロマトグラフィー(UPLCテクノロジー)を実行する新しい総合的なシステムを作成する必要がありました。

現在、複数の科学者により、さらに微細な直径1 μmの粒子を持つカラム、および100,000 psi(6,800 bar)で動作可能な装置を用いて基本研究が行われています。この研究により、将来予測の一端が得られます。